蓝白斑实验汇总

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1、什么是蓝/白斑筛选，怎么进行蓝/白斑筛选载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体pGEMZ的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏

2、，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG,40ug/mlX-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal和100ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X-Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。IPTG和X-Gal需分装后保存在-20oC，可保存2-4个月。蓝白斑选择原理：①    Xgal（

3、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物；②       b-半乳糖苷酶与Xgal显色反应是通过b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝；③lacZ的a肽互补：a-肽（lacZ’）是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。若受体菌lacZ突变（lacZ?M15），b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal

4、。如受体菌株JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a等。而pUC质粒载体上的lacZ’编码a肽与这个缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体的a-肽，故能分解Xgal。产生蓝色物质。   ④a互补的插入失活：pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。   ⑤IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和

5、载体的lacZ’a肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生a肽。   ⑥IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑，MCS有插入时，不互补，白菌斑（见下图）。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作为lac操纵子的诱导物，但不能作为反应的底物；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）可作为lac操纵子的底物，但不能作为诱导物。底物X-gal还可充作生色剂，被β-半乳糖苷酶分解后可产生兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色你的空载提转进去的话，IPTG诱导lacZ'表达α肽，互补

6、体内缺陷的酶，然后可降解底物X-gal，产生蓝斑；如果你则载体的多克隆位点插入了片段，导致编码的α肽错误，或者不能编码α肽，也就不能产生正常功能的酶，无法分解X-gal，所以长白斑。α互补人们发现lacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（α肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做α互补（α-complementation）。　　α-互补是指lacZ基因

7、上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由1024个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac操纵子中的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因，无酶学活性。对于只编码N-端140个氨基酸的lacZ基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两

8、个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。　　在lacZ'编码区上游插入一小段DNA片段（如51个碱基对的多克隆位点），不影响β-半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该DNA