n亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖非病毒转基因载体的研究

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1、摘要本工作采用均相反应法制备N．亚甲基磷酸化壳聚糖衍生物(NMPCS)，研究了其与DNA的复合能力，并将所形成的复合物用于介导体外基因转染，同时考察了载体及其复合物的细胞毒性，主要内容包括以下四个部分：(1)以红外光谱(FT-m)分析表明改性后的壳聚糖的特征基团有显著变化：13CNMR检测进一步证明了亚甲基磷酸基团的引入，结合元素分析确定了取代度。(2)通过复凝聚的方法，制备了纳米尺寸的Ⅻ仰CS／D_NA聚电解质复合物。考察了共聚物与DNA的相互作用情况，复合物中DNA的构象变化和复合物的形态和粒径。圆二色谱结果表明DNA与壳聚糖作用形成纳米尺寸的复合物后仍

2、然保持着典型的B型构象。透射电镜，原子力显微镜检测结果表明，不同N／P下的N．亚甲基磷酸化修饰的壳聚糖／DNA纳米复合物呈现较规则的球形，且在高电荷比时可形成尺寸较小的纳米尺度颗粒。(3)以人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa为宿主细胞，尝试了以NMPCS为载体介导含荧光素酶的pGL3质粒的体外转染，重点研究了pH值和N／P比对转染效率的影响。实验结果表明，载体可有效将质粒转染HeLa和HepG2细胞，获得的最佳转染效率远高于裸DNA和CS，与PEI相当。基于磷酸基团对钙离子有良好的鳌合能力制备了聚合物盐型NMPCS．Ca载体，并用于介导基因转染，其转

3、染过程类似于传统的P．Ca载体，并认为Ca2+离子通道促进了转染过程。考察了16一CS和NMPCS载体协同介导基因转染研究，结果表明亲疏水相互作用影响复合物的形成和基因转染活性。(4)利用MTT实验初步研究了衍生物载体及其复合物在上述两种细胞中的毒性，结果表明在实验条件下，载体和复合物的毒性要远远小于同等浓度时PEI的毒性，而载体的毒性要稍高于对应复合物的毒性，且体现一定的浓度依赖性。关键词：非病毒载体，基因运载，壳聚糖，自组装，亲水性／亲油性ABSTRACTInthisstudy,N-methylenephosphonicchitosan(卜mmCS)，锄

4、amphiphilicmaeromoleculewithpowerfulchelatingabilityofCarions，Wassynthesizedandcharacterized,theinteractionsbetweenNMPCSandplasmidDNA，thegenetransfectionanddeliverymediatedbyNMPCS／DNAcomplexes，andcellcytotoxcityofthederivativeandtheircomplexeswerealsoinvestigated．Themainworkissumma

5、rizedasfollows：(1)N-methylenephosphonicchitosan(NMPCS)wassynthesizedusingaone-stepreactionthatallowedhomogeneousmodificationswithoutanysharpdecreaseinitsproperties．FT-IR,¨CNMR，andelementanalysispermittedtheidentificationofthestructureandthedegreeofsubstitutionofNNmCS．(2)NMPCS／DNAco

6、mplexeswereobtainedusingacomplexcoacervationprocess，characterizedbyagarosegelelectrophoresisretardationassayfortheirstabilities，atomicforcemicroscopy(AFM)，transmissionelectronmicroscopy(TEM)andlasersizeanalysizerobservationformorphologyandsize，resultsshowedthatatchargeratio2：1orabo

7、ve，DNAcouldbecompletelyentrappedandsphericalcomplexeswithmeansizeof80-210nmwereformed，CDspectraverifiedthatthe’、interactionbetweenDNAandNA口CScausedaslightperturbationonDNAbondsandDNAstillremainedB—conformationwithinthecomplexes．(3)ComplexeswerefurtheremployedtotransfeetHeLaandHepG2

8、cells，andtransfectioneffic