小反刍兽疫核酸疫苗的初步研究

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1、新疆农业大学硕士学位论文小反刍兽疫核酸疫苗的初步研究姓名：朱学亮申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：才学鹏;岳城20090501小反刍兽疫核酸疫苗的初步研究摘要小反刍兽疫是一种急性、烈性、接触性传染病，可感染山羊、绵羊、小鹿瞪羚及长角羚等，发病率和致死率均非常高，为重大跨国传播的动物疫病，被世界动物卫生组织(O正)列为法定报告的动物疫病。该病的病原为副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus，PPRV)，其基因组为单股负链无节段RNA，有

2、六种结构蛋白，分别由六个基因编码，从病毒核酸的3’至5’端依次排列为N⋯PMF-H．L。该病毒只有1个血清型，但根据病毒基因组序列差异可将PPRV分为4群，其中3个群源于非洲，1个群源于亚洲。目前，在小反刍兽疫流行的国家，用小反刍兽疫弱毒疫苗接种是控制该病的主要手段。弱毒疫苗具有制备容易，可以大规模生产，保护率较高等优点，但弱毒株具有毒力返强的可能性而存在安全方面的隐患。因此，研制安全高效的新型小反刍兽疫疫苗，为我国防制小反刍兽疫做好技术和物质储备是当务之急。本研究根据GenBank中登录的PPRVNigeria75／1基因序列设计引物，利用RT-PCR技术从

3、PPRVNigeria75／1毒株病毒总RNA分别扩增其H和F基因，连接到pGEM-TEasy载体并进行序列测定。结果表明获得的F、H基因核苷酸序列分别为l641和I830bp，与GenBank中对应基因的同源性为达99％以上。另外分别设计引物以重组质粒pGEM-F、pGEM．H为模板进行PCR扩增，获得F、H基因的胞外区FM和HM，然后利用PCR的方法将F、H基因的胞外区连接。连接产物克隆到pGEM．TEasy质粒并测序鉴定。将pGEM—F、pGEM．H、pGEM．H—FM质粒分别进行酶切，回收目的片段，与同样酶切的pEGFP-N1载体连接，构建重组真核表达

4、载体pEGFP—F、pEGFP．H、pGEM．H～d-FM。将这三种重组真核表达载体转染BHK-21细胞，用间接荧光抗体方法检测F、H、HM+FM蛋白的表达情况。荧光显微镜镜检结果显示，三种重组质粒转染后细胞内有强荧光信号，阴性对照细胞和pEGFP-N1空载体转染细胞内未观察到特异性荧光，说明F、H、H～d-FM三种蛋白在细胞内成功表达。提取pEGFP．F、pEGFP-H、pEGFP-HM+FM重组质粒，按2009tg／只的剂量经肌肉注射免疫健康山羊，同时设空白和弱毒疫苗免疫对照组，在免疫后不同时间采血进行抗体测定。结果表明pEGFP．F、pEGFP．H及pE

5、GFP-HM+FM免疫组的山羊血清抗体在免疫后第4周达到最高峰值，之后逐渐下降，而弱毒疫苗免疫组山羊的抗体在免疫后第3周达到最高峰值之后开始下降；同时还发现三种重组真核表达质粒免疫组抗体效价始终高于弱毒疫苗免疫组，这表明这三种重组真核表达质粒具有良好的免疫效果。该研究为小反刍兽疫核酸疫苗的研制奠定了基础。关键词：小反刍兽疫病毒；血凝素基因；融合蛋白基因；真核表达；核酸疫苗；山羊PreliminaryStudyonNucleicVaccineAgainstPestedesPetitsRuminantsAbstractPestedespetitsruminants

6、(PPR)isanacuteandmgmycontagionsviraldiseasewithahighmorbidityandmortalityratesingoats，sheep，dorcasgazellesandgemsboks．PPRisatransnationallyspreadanimalplagueandwasrecognizedasofficiallyreporteddiseasebyOIE．Pestedespetitsruminantvirus(PPRV)，whichbelongstoParamyxoviridaeandMorbillivir

7、us，hasasingle-strandednegativesenselinearRNAgenome．ThegenomeofPPRVencodessixstructuralproteinswhichisnamedN，P，M，F，HandL．AlthoughPPRVhasonlyoneserotype，foursubtypeshavebeenidentifiedwithinthePPRVaccordingtothevirusgenomesequence．ThreeofthemderilredfromAfricanandonederiredfromAsia．The

8、attenuatedvirusvacc