血管内皮生长因子对抗顺铂诱导舌鳞癌细胞凋亡作用的实验研究

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1、牲科学发展观促进科技创新(三)657TfmW内皮生长因子对抗顺铂诱导舌鳞癌细胞凋亡作用的实验研究④房思炼1黄洪章2孔祥波2王勇3游云华1王建广2吴忠道41．中山大学附属第五医院口腔颌面外科，广东珠海，519000；2．中山大学附属第二医院口腔颌面外科；3．南方医科大学珠江医院临床药理基地；4．中山大学基础医学院病原微生物教研室摘要目的：在建立的顺铂诱导舌鳞癌细胞凋亡的体外模型上，研究VEGF对舌鳞癌细胞凋亡的影响。方法：分别采用MTT法、倒置相差显微镜观察、DNA琼脂糖凝胶电泳法、TuNEL原位标记法及流式细胞术等多种手段检测舌鳞癌细胞的凋亡、坏死及存活状态，以观察OinglmL、lng

2、／mL、lOngfmL、lOOng]mL外泺性VEGF对颇铂诱导的TCa8113细胞凋亡的作用，并同时观察0．04ng／mL、0．4#g／mL抗人vEGF单克隆抗体与vEGF作用后．其作用的变化。结果：不同终浓度的ⅦGF均可对抗15t,g／LCDDP谤导Tca8113细胞凋亡的作用。VEGF既可延缓细胞凋亡的启动，又可降低细胞凋亡率，且随VEGF的浓度升高，这种作用逐渐增强。同时，证实抗人VEGF单抗可拮抗VEGF对抗凋亡的作用，且呈剂量依赖性趋势。同时结果也提示，VEGF对抗凋亡的作用具有一定的时效性。结论：vEGF具有抑制舌舛癌细胞凋亡的生物学作用，从而起到间接保护其生存的作用。本实

3、验结果提示我们。对肿瘤细胞的耐药机制应有多方面的认识，才能审l定曼合理而有效的治疗策略。关键词口腔医学血管内皮生长因子鳞状细胞癌凋亡血管内皮细胞生长匮I-T-(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是近年来发现的最重要的促肿瘤血管生成调控因子。新近研究表明，VEGF尚具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用。本实验采用15t*g／mLCDDP诱导的人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡作模型，在体外实验中观察加入外源性VEGF对Tca8113细胞凋亡的作用，探讨VEGF在舌鳞癌化疗抵抗中的作用。一、材料与方法(一)材料1．细胞株人舌鳞癌细胞株Tea8113，引自上海第二医科

4、大学第九人民医院口外实验室。2．主要试剂胎牛血清、RPMI1640、四氮甲唑蓝(MTT)、碘化丙啶(pmmideiodine，Pi)、TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒、VEGF及anti—humanVEGFmonoclonalantibody，其余试剂均为分析纯试剂。①基金项目：广东省自然科学基金(021837)、广东省医学科学研究基金(A2002197)资助。658兰竺兰竺竺苎堡兰坠兰竺兰兰====；—=======；===$d===========；==========；i=============口i———————————————————一(二)方法1．细胞培养7Yca8113细胞

5、用含10％FCS的RPMI1640(含100U／L青、链霉素)，置37"C，pH7．2，5％C02培养箱中饱和湿空气传代培养，2～3d换液。实验时，取对数生长期细胞，消化后收集细胞并以1000r／min离心10min，用Hanks液洗涤两次后计数，再用全培养液调整至所需细胞浓度备用。2．舌鳞癌细胞增殖状态的检测取以上细胞以每孔1．2×104个细胞接种于进口96孔培养板中培养24h后，倾弃培养基，用Hank’s液洗涤两次后，再培养于分别含终浓度为01、1、10、100ng／mLVEGF和15pg／mL的CDDP的10％FCSRPMI1640，或含0．04、0．4"g／mL的抗VEGF单克隆

6、抗体、10ng／mLVEGF和1599／mLCDDP的10％FCSRPMI1640，每组设3个复孔，对照组为全培养基，调零组为不含药物及细胞的培养液。培养到6、12、18、24、48h前4h，每孔加新鲜配制MTT液(5mg／mL)20td，继续培养4h至出现蓝色结晶，加DMS0150v1／孔，振荡10min溶解，用酶联免疫检测仪于490nm波长测定吸光度值，每组3个孔数据取均数。以时间为x轴，吸光度值为Y轴作图，动态描述各组细胞的增殖状态。3．外源性VEGF对CDDP诱导的舌鳞癌细胞凋亡的影响取对数生长期细胞以1×106／皿分种于35mm塑料培养皿中(10％FCSRPMI1640培养液体

7、积为1．5mL／皿)培养24h，倾弃培养基，Hank’S液洗涤两次，在各培养皿中分别同时加入终浓度0．1ng]mL、lng／mL、10ng／mL、100ng／mL的VEGF和15飕／mL的CDDP的10％FCSRPMI1640，或终浓度0．0499／mL、0，4旭／mL的抗VEGF单克隆抗体、10ng／mLVEGF和15pg／mLCDDP的10％FCSRP—MI1640，培养6h、12h、18h、24h，进行以下各项细胞凋亡指标的检