hcv+ires小鼠体内长期表达模型的建立及其在药物评价中的应用

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1、博}学位毕业论文：HCVIRES小鼠体内长期J表达模型的建扛及茸在药物评价中的应用军事医学科学院研究生学位论文独创性声明秉承军事医学科学院严谨的学风和科研作风，本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得芏主堕茔型鲎瞳或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签字：‘至苎苤签字日期：丝：年—二月三生日论文作者签字：之竺笙签字日期：丝!年—二月兰二日军事医学科学

2、院研究生学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解芏壹堕鲎盘鲎瞳有关保留、使用学位论文的规定。特授权至主医堂盘堂瞳可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意将本学位论文的复印件和磁盘送交国家有关部门和机构。(保密学位论文在解密后适用本授权书)论文作者签字指导教师签字塑：查垄已令茏签字日期：珈7年j--月2妒日签字日期：坐)年』二月兰生日博i：学位毕业论文：HCVIRES小鼠体内K期表选模型的建色及其在药物评价中的臆用HCVIRESd,鼠体内长期表达模型的建立及其在药物评价中的应用学位申请人姓名：

3、孙志东申请学科门类和级别：医学博士导师：王全立研究员专业名称：免疫学年级：2004级培养单位：军事医学科学院野战输血研究所学号：042163专业代码：100102摘要丙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的疾病。丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCv)急性感染后50％．80％转变为慢性感染，其中的10％．20％发展成肝硬化，且与肝细胞癌的发生密切相关。目前尚无有效疗法，加强对HCV防治研究至关重要。丙型病毒性肝炎治疗的主要策略之一是针对病毒基因组或其所表达的关键蛋白进行抗病毒治疗，其中内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IR

4、Es)是目前抗病毒治疗研究的主要靶位之一。HCVIRES是一个双功能分子，一方面介导并控制着整个HCV基因组的翻译过程；另一方面HCVIRES抑制PKR的活性从而降低干扰素抗病毒的效果，且IRES又是HCV基因组中最保守的序列，因此，研究靶向HCVIRES的拮抗剂具有十分重要的意义。多年来针对HCVIRES抑制剂的研究取得可喜的进展，寡核苷酸适配子(Aptamers)和干涉性小dsRNA(siRNA)等药物在体外或细胞体系均显示出良好的抗病毒作用。但由于缺乏理想的HCV感染小动物实验模型，这些药物在体内抗HCV的作用效果以及对其毒性、安全性等难以作出评估，极大地延缓了这些

5、药物临床应用。本课题基于成年小鼠，联合应用水动力转染技术与噬菌体整合酶系统，建立HCVIRES小鼠体内长期表达模型，作为经典转基因技术的补充或替代，用于评估HCVIRES抑制剂—shRNA、寡核苷酸适配子(Aptamers)等在体内抗HCV的博J二学位毕业论文；HCVIRES小鼠体内长期表达模帮的建赶及J￡在药物评价中的应用作用效果。具体研究内容及结果如下：1．构建了可促进外源基因在小鼠体内长期高水平表达的质粒pCI．attB．AAA．HCVIRES．Flue．neo。该载体含有肝脏特异性调控序列组合AerApoEAAT(AAA)与噬菌体整合酶4,C31．int识别位点a

6、ttB，报告基因Flue的表达活性代表了HCVIRES的功能。将pCI．attB-AAA．HCVIRES．Flue．neo与对照载体pCI-attB-CMV-HCVIRES．Flue．ne,o分别转染至小鼠肝脏，实验证实，肝脏特异性启动子AAA启动效率虽略低于CMV启动子，但它使Flue表达持续时间长于CMV启动子，达20d左右。此外，水动力转染技术对小鼠肝脏无明显病理损伤，不同种属小鼠间Flue的表达也无显著影响。2．利用庐c31-int介导位点特异性整合反应的特点，建立HCVIRES介导Flue在小鼠内长期表达模型。通过水动力转染将表达载体pCI．attB．AAA．H

7、CVIRES．Flue．neo与编码野生型妒c31．int的表达载体pcMVint共转染至小鼠体内。实验证实，在,kC31一int作用下，Flue表达框架整合到小鼠肝脏染色体上，Flue在小鼠肝脏获得长期表达，在共转染后30d左右其表达趋于稳定，可长达300d。对获得稳定表达Flue的小鼠行2／3肝脏切除术，2周后小鼠Flue的表达随肝脏组织再生而逐步恢复，表明Flue表达框架整合至小鼠染色体上。nest．PCR结果进一步证实，Flue表达框架在小鼠第2号染色体的mpsL-位点处发生位点特异性整合，生成两个杂合位点attR和a