小鼠肝再生蛋白表达谱分析

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1、温州医学院硕士学位论文-_■^oo●一刖盖肝脏作为重要的生理器官，具有很强的代谢能力，但就细胞分化来说，它并不是一个活跃的器官，极大部分的肝细胞在通常情况下处于静止状态，只有0．001％～0．01％的肝细胞在进行有丝分裂⋯。然而在肝脏遭受损伤时，这种低分化状态可以发生改变，手术切除或毒性损伤可以引起快速广泛的肝细胞增殖。比如大鼠肝脏被切除2／3体积后，残余肝细胞迅速增殖，残余肝脏2周内即可恢复到手术前重量，当肝重达到体重的一定比例，细胞分化即行终止，从而完成肝脏的再生。然而肝脏再生过程相当复杂，传统的研究方法很难全面有效地进行分析。研究人员曾运用cDNA文库

2、杂交方法和二维电泳分离技术，力图在基因水平上研究切除2／3体积肝脏后的大鼠肝脏再生机制。他们比较分析了肝脏部分切除后18h与正常的肝实质细胞基因表达情况，以确定是否存在基因表达上的差异，结果发现再生时期基因表达主要在量上发生变化，而不是出现新的基因表达，而且这些基因在通常情况下也是低表达的，很难从基因的层次说明肝脏再生的整体变化【2】0由于常规技术和研究方法的限制，研究人员开始把目光投向在生物体内执行实际功能的蛋白质。根据WiIkinsMR等【3j的定义，”proteomiCS”一词意指“是细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质”。蛋白质组(Pr

3、oteome)这一概念具有整体性、动态性和系统性的特点。它对应于一个基因组的全部蛋白质所构成的整体，而不限于一个或几个蛋白质。目前定义为由单个细胞、器官或组织类型所表达的整套蛋白质。蛋白质组学则是应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是对基因组所表达的整套蛋白质的分析。蛋白质组学研究具有大规模、高通量、高灵敏度的特点，可以有效分析细胞内的整体蛋白质。蛋白质组学的研究主要有两条途径，一条是像基因组学的研究一样，力图“查清”人类所有基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质组学数据库。随着对蛋白质组学的研究，人们认识到在短时间内是难以实现的。另一条途径称为

4、差异蛋白质组学研究，是着重于寻找和筛选几个样本之问的差异蛋白质图谱，揭示细胞生理和病理的进程与本质，以及细胞的调控机制，同时获得对某些关键蛋白的功能分析。只要能够获得它们在蛋白质组上的差别的足够信息信息，就能够指证这个细胞或生物体所处的状态，以及它们的状态是否正常，从而找出导致功能异常的原因。因此，通过差异蛋白质组学的研究能够动态、整体、定量地研究肝脏损伤后肝再生过程中蛋白质种类、数量的改变，有助于寻找影响肝脏再生的一些关键因子【4】。本研究拟采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术检测在肝切除小鼠中肝脏温州医学院硕一l：学位论文蛋白表达谱的变化规律，从而对肝脏的

5、再生机制进行初步探讨。6温州医学院硕．}：学位论文材料和方法一、实验材料1、实验动物C57／BL6雄性小鼠6只，购自四川省医学科学院实验动物研究所，所有动物实验的操作规程和协议都按照温州医学院动物保护和使用委员会颁布的实验动物使用和保护指导守则进行。2、实验仪器1)U570超低温冰箱(NEWBRUNSWICKSCIENTIFIC英国)2)SANYO．U333低温冰箱(SANYO日本)3)D．37520冷冻离心机(THERMO德国)4)5417R低温高速离心机(EPPENDORF德国)5)420定轨摇床(THERMO美国)6)PowerpacTMHC垂直电泳仪

6、(BIO．RAD美国)7)NanoAcquityTM—U1traPerformanceLC串联MALDIQ．TOFpremier(WATERS美国)3、主要试剂及配方1)T-PER组织蛋白抽提试剂，SDS．PAGESamplePrepKit，BCA蛋白定量试剂盒，胶内酶解试剂盒，(均购自PIERCE公司)；2)10％分离胶配方(10m1)：双蒸水4．6ml，30％丙烯酰胺2．7ml，1．5Mol／LPH8．8Tris2．5ml，10％SDS0．1ml，10％过硫酸铵0．1ml，TEMEDO．006ml；3)浓缩胶配方(2m1)：双蒸水1．4ml，30％丙烯酰

7、胺O．33ml，1Mol／LPH6．8Tris0．25ml，10％SDS0．02ml，10％过硫酸铵O．02ml，TEMED0．002ml；4)30％丙烯酰胺：299丙烯酰胺，19N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，100mlddH20温热溶解，0．45um滤器过滤除菌，棕色瓶中保存于4V冰箱；5)1Mol／LTris．HCl(pH6．8)称取Tris碱6．29，加入约30mL水，充分搅拌溶解后，用浓盐酸调节pH值至6．8，加水定容至50ml；6)1．5Mol／LTris．HCl(pH8．8)称取Tris碱9．69，加入约30mL水，充分搅拌溶解后，用浓盐酸调节pH

8、值至8。8，加水定容至50ml；7)30％SDS：1