沙田柚花柱自交不亲和相关基因的克隆与鉴定 (1)

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1、第一章综述1抑制性消减杂交（suppressionsubtractivehybridization，SSH）[1]1996年，Diatchenko等首次报道了抑制性消减杂交方法。这一方法事实上是由Clontech公司、加州大学旧金山分校和俄国科学院合作研究报道的，并于1998年由Clontech[1,2]公司将其商品化，开发成SSH消减文库构建试剂盒。SSH技术是一种比较和分离不同细胞系、不同组织或同一细胞系、同一组织在不同条[3]件下差别表达基因的方法。经过数年的实践运用，它已成为一种研究生物的生长、发育、[4]抗病

2、、抗逆等生命过程相关基因的差异表达及克隆的有效途径。1.1SSH技术的基本原理SSH的基本原理：利用消减杂交和两次抑制PCR，使差异表达基因的cDNA片段得到[4]高度富集，从而实现对差异表达基因的分离和克隆。消减杂交运用了杂交二级动力学原[5]理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而在杂交过程中，使丰度高的单链cDNA杂交形成双链，在杂交完毕后，原来在丰度上有差别的单链cDNA达到基本一致。抑制PCR是利用DNA链内退火优于链间退火，且比链间退火更稳定的动力学特性，使非目的

3、系列片段两端反向重复序列在退火时产生类似[4]“锅柄”的结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因序列片段的扩增。具体过程如下（见附录图1和2）：⑴cDNA的合成与酶切：抽提两种不同来源（检测子tester和驱动子driver）的mRNA，反转录合成双链cDNA。将tester和driver双链cDNA分别用RsaI或AfaI等四碱基识别4酶酶切为较短的平头末端。理论上这些酶在每4=256bp处就有一个酶切位点，因此双链cDNA经酶切后可产生许多个小片段。这些小片段可以降低杂交过程中形成的复杂二级结构对杂交的阻

4、碍作用，小片段的形成还为单个基因提供了更好的代表性，从而增加检出差[4,6]别表达基因的可能性。⑵接头连接：将酶切后的tester产物分成两等份，一份与接头1连接，另一份与接头2R连接，而driver则不进行接头连接。接头是由一长链（约40余个核苷酸）和一短链（约10个核苷酸）组成的一端是平端的双链DNA片段，其末端均设计为没有磷酸基团，以便于长链的3’端与cDNA的5’端共价结合。接头长链外侧序列（22bp）与第一次抑制PCR[4]引物相同，内侧序列（约20bp）与第二次抑制PCR引物相同。⑶第一次消减杂交：分别向连

5、接好不同接头的testercDNA中加入过量的drivercDNA进行不充分杂交。tester与driver序列相同的片段形成双链片段，而留下各自有差别表达的片段，从而使testercDNA单链均等化，即有丰度差别的cDNA相对含量大体相等。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复性，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在，在不充分杂交后，各种单链分子在浓度上基本相同，达到均一化高丰度表达基因的cDNA的作用。另外，由于testercDNA和drivercDNA中序列相同的片段形成了异源双链分子，1使testercDNA

6、单链中的差别表达基因的目标cDNA得到显著富集。杂交完成后将形成四种产物：a，均一化了的差异表达的单链testercDNA；b，自身退火的testercDNA；c，异源退火的tester/drivercDNA（共有序列的异源杂交产物）；d，自身退火的drivercDNA及[4]单链drivercDNA。⑷第二次消减杂交：将第一次杂交的两份产物混合，并加入新变性的drivercDNA，进行第二轮消减杂交，以进一步去除共有序列。此时，只有第1次杂交后的经均等化和扣除的单链testercDNA可与drivercDNA结合形成

7、杂交双链和一种新的e型杂交双链。e型杂交双链是由连接有不同接头的差异表达单链testercDNA片段退火形成的。正由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中有效地以指数形式扩增，进一步富集了在tester和[4]driver样本之间所存在的那些有差别表达的序列片段。⑸第一次抑制PCR：消减杂交完成后，在PCR扩增反应前，应先用DNA聚合酶将cDNA链接头上的粘性末端补齐，然后加入根据接头长链序列设计的外侧引物，进行第一次抑制PCR扩增。a,b,c,d,e五类分子在PCR反应中具有不同的表现：a为一端带接头的单链，d为

8、两端都不带接头，a,d两类分子因无引物结合位点不能扩增；c类是带有一端相同接头的双链，只能线性扩增；b类分子两端具有相同接头，在PCR反应的变性和复性过程中，长的末端反向重复序列容易分子内自我复性形成“锅柄”样（panhandle-like）结构，阻抑了PCR扩增，这便是抑制PCR作用（如附录图2所示）；只有目标片段形成的e[4]