cody转录调节因子对猪链球菌2型毒力的调控研究

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1、华中农业大学硕士学位论文CodY转录调节因子对猪链球菌2型毒力的调控研究姓名：冯丽萍申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：贝为成201206CodY转录调节因子对猪链球菌2型毒力的调控研究摘要猪链球菌2型是一种重要的人畜共患病原菌(Streptococcussuisserotype2。SS2)，其感染不仅严重危害当前养猪业健康发展，而且还危害威胁着人类的生命健康。近年来，关于猪链球菌2型致病性的研究越来越受到各国学者的重视，目前除了一些经典的毒力因子如荚膜多糖、溶血素和胞外释放因子外，也有很多新型的毒力相关因子被证实，如双组份调控系统SalK．SalR、CiaRH、孤儿调控因子CovR

2、、内皮素转换酶SsPep等等。尽管很多学者从不同的角度研究解释猪链球菌2型的致病机理，但由于SS2致病是众多毒力因子的协同作用，因此通过单个的毒力因子很难完全解释其致病机理。实际上，对于病原菌来说最有效率的方式就是于通过大量转录调控因子的相互作用，形成一个精细的全局调控网络来调控整个细菌基因组的表达。目前对化脓链球菌的全局调控网络已经有了很深入的认识，但是对于SS2来说这方面的研究还很有限。CodY是多种革兰氏阳性茵一种重要的全局性转录调控因子，可调控大量毒力基因的表达，从而影响病原菌致病性。在化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等病原菌中均有COd珊究报道，但目前未见CodY在猪链球菌2

3、型中毒力调控相关报道。本研究在SS2中国强毒株05ZYH33鉴定了一个CodY转录调节因子，通过构建COd珐因突变株，研究突变株体外生物学特性，进一步通过基因表达谱芯片筛选CodY可能调控的差异表达毒力相关基因，并利用荧光定量PCR进行验证，探讨CodY对猪链球菌2型毒力调控机制，为深入阐明猪链球菌2型的分子致病机理提供理论基础，同时为猪链球菌新型疫苗和药物靶标的分子设计提供新的思路。具体实验内容如下：1．猪链球菌2型转录调节因子CodY突变株Acod蹦构建和鉴定参考猪链球菌2型05ZYH33全基因组序列，设计引物，以猪链球菌2型四川分离株(SCl9)基因组DNA为模板，扩增codY内部一段

4、基因codY’，这段基因不包括起始密码和功能域(Helix．Tum．Helixdomain，HTH)，利用温度敏感型型自杀性质粒pSET4s，构建重组质粒pSET4s．codY’。将重组质粒pSET4s．codY’电转化到野生菌株SCl9感受态细胞中，利用壮观霉素和温度筛选获得突变株。通过PCR、RT．PCR，测序和Westernblot等证实codY突变株构建成功，并将突变株命名为AcodY。2．猪链球菌2型AcodY的基本生物学特性研究对突变株AcodYJ拄行基本生物学特性的研究，包括生长速率的测定、形态结构观察、溶血活性、细胞感染实验、小鼠半数致死量计算和组织载菌量的测定等。研究结果表

5、明，AcodY"-牛长速度显著减缓；荚膜变薄且更疏松；细菌溶血能力减弱；对HEp．2细胞的粘附能力下降，对于中性粒细胞和巨噬细胞的抗杀伤能力减弱；小鼠半数致死量结果表明，突变株AcodY比野生株毒力降低5．68倍；血液、肺脏、心脏华中农业大学2012届硕士研究生学位论文和脑等组织器官中载菌量均低于野生株，且更易被清除。以上研究结果，突变株Acod璃力显著低于野生菌株。3．猪链球菌2型CodY调控机制及其致病机理的探讨通过基因表达谱芯片，对突变株Acod屿野生菌株SCl9差异表达基因进行分析，结果显示：在整个基因组2178个基因中，表达下调2倍以上的基因有164个，包括毒力相关基因、荚膜合成相

6、关基因等；上调表达2倍以上的基因有214个，包括多种氨基酸合成相关基因、氮代谢相关基因等。选取部分毒力相关基因，进一步通过荧光定量PCR验证了芯片结果的可靠性。通过电泳迁移实验(Electrophoreticmobilityshiftassays，EMSA)探索转录调控因子CodY与一些毒力基因启动子结合特性。结果证实CodY能够与启动子特异性结合，直接调控这些毒力基因的表达，从而影响猪链球菌2型的致病性。关键词：猪链球菌2型；转录调控因子；CodY；毒力因子；转录调控2AbstractStreptococcussuisserotype2(ss2)isoneofthemostimportan

7、tswinepathogens，andallemerging，life．threateningzoonoticagentinbothpigsandhumans．．Inrecentyears，manyresearcherspaymoreandmoreattentiononthepathogenicofStreptococcussuisserotype2．Withtheexceptionofsomeofthetr