rkip相互作用蛋白在胃癌发生发展中的作用及机制研究

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1、分类号VDC博士学位论文密级RKIP相互作用蛋白在胃癌发生发展中的作用及机制研究T。mechanismesearchofproteinsthatllemecllanismresearch0IDroteinsthatlinteractwiththenovelgastriccancerrelatedprotein瑚P作者姓名：谷欢学科专业：内科学学院(系、所)：湘雅医院指导老师：张桂英教授论文答辩日期三翌三羔乡答辩委员会主席中南大学二0一二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以

2、标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：二叠呈垦．日期：迎年￡月旦日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社

3、会公众提供信息服务。作者签名：签墼导师签名兰丝篁笙荔日期：坦年上月翌日博士学位论文中文摘要研究背景：胃癌(gastriccancer，GC)是目前世界上发病率第四位的肿瘤，居消化道恶性肿瘤发病率及病死率之首‘1。21。全世界每年有750000患者死于胃癌，我国每年有16万人死于胃癌。迄今为止，胃癌的发病机制仍然不清楚。在胃癌的防治中胃癌早期诊断、复发转移预测和预后评估具有重要作用。寻找新的肿瘤标志物及基因治疗靶点成为当务之急。RKIP是一种高度保守、广泛表达、具有多种生理与病理功能的小分子胞浆蛋白。RKIP又名PEBPl(磷脂酰乙醇胺结合蛋白1)，近期研

4、究‘3‘61发现其表达下调或缺失在多种肿瘤发生发展中具有重要的作用，因此RKIP在恶性肿瘤中的作用机制已经成为肿瘤领域一个新的研究热点。我们前期研究发现Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein)即RKIP在胃癌中存在表达下调或缺失，其表达改变可能与胃癌的发生、分化、浸润及转移有关‘71，但是RKIP在胃癌发生和转移中的作用及其机制国内外均未见报道。有研究认为细胞中绝大多数酶的功能和调控过程是由蛋白质复合体或蛋白质网络协同作用实现的。因此我们在前期研究的基础上，应用亲和纯化耦联质谱为主的靶向蛋白质组学技术分离、鉴定胃癌细胞SG

5、C7901中RKIP相互作用蛋白，以探讨RKIP抑制胃癌的发生发展的分子机理，为胃癌的早期诊断、预后监测及靶向基因治疗提供依据和新的线索。本课题受国家自然科学基金I(No．81072038)项目资助。博士学位论文中文摘要第一章pCDNA3．1一PEBPl-3xFLAG表达载体构建目的：构建3xFLAG标记的PEBPI(BPRKIP)融合蛋白表达载体。方法：(1)根据Sigma公司的p3xFLAG．CMV-14载体上对应序列合成3XFLAG；(2)PCR扩增PEBPlCDS区，同时引入3)(FLAG标签；(3)用HindlII和XhoI将PEBPl．3xF

6、LAG的PCR片段及目的载体pCDNA3．1(+)双酶切，然后进行连接。酶切、测序等鉴定重组质粒；(4)测序正确的质粒转化至感受态大肠杆菌，扩增并大量提取质粒。结果：(1)成功合成3xFLAG序列；(2)将3xFLAG标签序列引入PEBPl基因序列C端，双酶切鉴定克隆正确；(3)将联合基因片段连接至pCDNA3．1载体，并测序证实基因片段序列完全正确。结论：成功构建融合基因载体pCDNA3．1．PEBPl．3xFLAG。关键词：PEBPl，RKIP,3xFLAG第二章RKIP相互作用蛋白的筛选目的：分离、鉴定胃癌SGC7901细胞中RKIP相互作用蛋白，

7、验证RKIP与HSP90、keratin、14．3．3的相互作用。初步研究RKIP抑制胃癌的发生发展的分子机理，为胃癌的早期诊断、预后监测以及靶向基因治疗提供依据和新的线索。方法：(1)通过脂质体介导将pcDNA3．1．RKIP．3xFLAG融合表达II博士学位论文中文摘要载体瞬时转染至SGC7901细胞，RT-PCR和Westemblotting分别检测转染细胞中RKIPmRNA和蛋白表达水平；(2)利用3xFLAG标签的亲和层析技术提纯RKIP蛋白复合体；1D．SDS．PAGE技术预分离蛋白复合体；(3)ESI．Q．TOF串联质谱分析鉴定RKIP相互

8、作用蛋白质；(4)数据库查询及蛋白质GO功能聚类分析。(5)大量收集SGC790