tpck对大鼠晶状体混浊的影响及机制的研究

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1、第二军医大学博士学位论文TPCK对大鼠晶状体混浊的影响及机制的研究姓名：崔蓓申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：柳林201205TPCK对大鼠晶状体混浊的影响及机制的研究捅要白内障是目前世界上影响人类健康的常见病，也位列我国第一位致盲的疾病，其发病机制尚不十分清楚。白内障的发生与多种因素有关，是多种因素综合作用的结果。比如晶状体蛋白的基因突变、晶状体遭受氧化损伤、辐射损伤、老化变性、葡萄糖过度刺激、半乳糖等代谢障碍、脂质过氧化损伤等均可对晶状体的正常功能造成不同程度的损伤，结果导致晶状体发生混浊，影响晶状体对光的透射和折射，从而造成视物不

2、清。氧化应激是由活性氧(ROS)诱导的一种与老化密切相关的损伤类型，与老年性白内障的形成有关，被认为是白内障的始发因素。晶状体产生的主要活性氧分子包括超氧负离子、羟自由基和H202；内源性产生的活性氧的结构包括NADPH氧化酶，线粒体和过氧化物酶体，两种主要产生内源性活性氧的途径是紫外线和离子辐射。晶状体中通过这些途径产生的ROS分子可以经由抗氧化剂和氧化防御系统中和，因此晶状体中具备这两大修复系统来重塑损伤分子或者减轻损伤程度。硫醇转移酶(thj01transferase，TTase)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TrX)和硫氧还蛋

3、白还原酶(thioredoxinreductase，TR)和谷胱甘肽还原酶(91utatllionereductase，GR)系统被认为是哺乳动物组织中强有力的蛋白修复系统。近年的研究显示TTase／GR和TⅨ／TR均存在于晶状体中，对保持晶状体的透明性有重要的作用。晶体蛋白是哺乳动物晶状体细胞质中的主要结构蛋白，根据其在电场中的迁移能力主要分为Q、D、丫三大类。目前对0【晶体蛋白的功能研究比较深入，它的分子伴侣作用已得到世界公认，丫晶体蛋白主要承担维持晶状体正常形态的作用，然而对p晶体蛋白的研究还较少，以往认为其与1，晶体蛋白一样作为晶状体

4、的结构蛋白存在，近年来p晶体蛋白成为研究热点，我们前期研究表明了它对维持晶状体的透明性和屈光度有一定的作用。晶体蛋白中均含有一定数量的半胱氨酸(Cys，0【B除外)，尤其是p、丫类含量较高，Cys含一游离的巯基(．SH)，对于氧化极为敏感；巯基经氧化作用形成二硫键混合物，是晶体蛋白去折叠、聚集增强的主要动因。由此产生一对矛盾：氧化应激会使巯基氧化，而为了保持晶状体的透光性，晶体蛋白必须维持足够量的还原状态的巯基(．SH)。晶体蛋白的翻译后修饰(post．translationalmodifiction，PTM)是白内障发病的主要诱因。晶状体是

5、一种结构极为特殊的器官：透明、缺乏血供，晶体蛋白缺乏转化更新、形成后即伴随终生。使晶体蛋白遭受PTM的可能性远较其它类蛋白大。PTM对晶体蛋白的主要影响是：极易引发晶体蛋白去折叠、改变蛋白原有构象：二硫键第二军医大学博士学位论文形成、晶体蛋白之间非特异交联，蛋白水溶性下降；聚集增强形成高分子量物质(Highm01ecularweight，HMW)，当HMW聚集达到1x107Da以上时，即可发生光散射，晶体失去透明性、发生白内障。那么如何保持晶体蛋白中．SH未被氧化交联为二硫键，进而阻断后续蛋白分子交联、聚集、沉淀，对维持晶体透光性及防治老年性

6、白内障起着关键的作用本课题组前期的研究成果表明了二硫苏糖醇(dithjo岫itol，DTT，分子式为C4Hl002S2)具有良好的抗晶状体蛋白变性的作用，DTT是一类化学性质的还原剂，它可以解开蛋白质分子内部及蛋白质分子间的二硫键，作为巯基的保护剂，能够抑制晶状体蛋白的热变性及非特异性聚集沉淀。课题组前期研究显示出在用自行配制的DTT滴眼液第8天后能使硒性白内障小鼠模型晶状体混浊的程度减轻。而且我们研究也显示出DTT对紫外线性白内障大鼠模型具有良好的抑制作用。DTT不仅可以防止蛋白质分子间形成二硫键，并且可以和蛋白质竞争性结合．SH，因此在预

7、防和治疗方面都发挥了一定的作用。前期实验也初步验证了异丙醇对晶体蛋白巯基的烷基化作用，通过封闭部分巯基，抑制了二硫化合物的形成。能够对蛋白质的巯基进行烷基化的试剂有很多，我们筛选出了一些化合物，例如叔丁醇(Ten-butylalcohol，"圆)、2．SH．3．丁醇、N．对甲苯磺基．L苯乙胺酰氯甲基酮、甲苯磺胺氯甲基酮等等，其中叔丁醇对硒性白内障的治疗作用也得到了我们初步的证实。N．对甲苯磺基．L．苯乙胺酰氯甲基酮(N-tosyl．L-phenylalanyl．c1110rometlIylketone，TPCK)，研究已经证实能够抑制细胞的凋

8、亡以及抗炎等作用对脑缺血有一定的治疗效果并初步应用于临床。对甲苯磺酰基(Tosyl，Ts)是一个由对甲苯磺酸衍生出的取代基，它是一个亲电子基，常用作醇羟基的保护基；