wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎轴索损害的病理学研究

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1、南方医科大学2009级硕士学位论文Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎轴索损害的病理学研究Pathologicalstudyonaxonalinjuryofaratmodelofexperimentalallergicencephalomyelitis课题来源：自选专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员神经病学王圆圆刘晓加教授吕田明教授徐书雯教授王彤歌教授罗一峰教授王群教授周曙教授论文评阅人潘小平教授周亮教授2012年3月20日广州硕士学位论文Jfl[IrPllJfIPIIJIllIllII]1IIIY225

2、7206Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎轴索损害的病理学研究硕士研究生：王圆圆指导老师：刘晓加吕田明摘要研究背景多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种免疫介导的中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)炎性脱髓鞘性疾病，临床上大多呈复发．缓解病程，疾病晚期可以导致患者的功能残疾。MS的组织病理学较为复杂，包括不同程度的反应性星形细胞增生、巨噬细胞活化、髓鞘脱失以及轴索损害等。实验性自身免疫性脑脊髓炎(expedmentalallergicencephalomyelitis，EA

3、E)是一种以特异性致敏的CD4+T细胞介导为主的，以CNS内小血管周围单个核细胞浸润及髓鞘脱失为主要特征的自身免疫性疾病，是人类MS的理想动物模型，在临床神经免疫学的研究中具有重要意义。不同的致脑炎抗原、免疫方法及不同的实验动物可制备各种类型的EAE模型，如急性型、缓解复发型和慢性型等。本研究使用含有髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)成分的豚鼠脊髓匀浆诱导雌性Wistar大鼠建立EAE模型，观察其发病过程的临床症状和病理学改变，以适应本实验研究的需要。炎性改变和髓鞘脱失一直是MS病理学研究的主要内容。然

4、而，近年来有大量证据表明，MS疾病后期不可逆的神经功能障碍与日积月累的轴索损害有着密切的联系，这种轴索损害在疾病早期就已存在。有研究表明，轴索损害对MS疾病的临床症状和预后有很大的影响，它和炎性改变、髓鞘脱失一样是MS病理摘要学的重要特征。MS不同阶段轴索损害的机制可能不同，疾病早期神经功能障碍可能是由于炎性脱髓鞘造成的急性轴索损害引起的。炎症条件下，各种炎性因子、一氧化氮、谷氨酸等毒性物质的积累会造成髓鞘和轴索破坏，一旦轴索损害发展到阈值时预编程的进行性神经功能退行性变就会被触发，因此我们应该在MS早期阶段积极抗炎治疗和保护轴

5、索治疗，预防和延缓神经功能残疾的发生。晚期的神经功能障碍则可能与慢性脱麓鞘斑块中缓慢进展的轴索损害有关。轴索损害越重，MS的预后越差。由此可见，轴索损害可以发生在MS早期阶段：轴索损害与患者永久性的神经残疾有关；轴索损害可以在MS缓解后的复发中发挥重要的作用；明确轴索损害的机制可以更好的指导MS的临床治疗策略。MS患者脱髓鞘斑块形成的早期即可出现淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein，APP)积聚，而APP积聚被认为是轴索损害的一个特征性标志，表明在患者脱髓鞘的同时轴索也受到损伤。神经丝蛋白是轴索细胞骨架

6、的主要组成成分，其磷酸化反应主要受髓鞘形成、髓鞘脱失和轴索的病理改变等影响。非磷酸化神经丝蛋白(Nonphosphorylatedneurofilament，SMI．32)多存在于神经元细胞的胞体和树突中，而有髓鞘包裹的正常轴索骨架中的神经丝蛋白多是磷酸化的，磷酸化的神经丝蛋白不会呈现SMI．32染色阳性，因此当发现大量SMI．32染色阳性纤维时即可说明轴索损害已存在。因此本研究在成功建立Wistar大鼠EAE模型的基础上通过不同的病理染色技术观察EAE的炎症浸润、髓鞘脱失和轴索损害的病理特征，重点探讨MS轴索损害的特点及其发生

7、机制，对深入探讨MS的发病机制、指导临床MS的诊断及治疗具有重要意义。方法l、豚鼠处死后于无菌条件下分离脊髓，加入少量的生理盐水研磨，制备新鲜的脊髓匀浆与等体积完全弗氏佐剂充分混合，配成抗原．佐剂乳化液(GPSCH．CFA)用于制备EAE动物模型。2、EAE模型组大鼠分为三个亚组：EAE免疫后第4天组(EAE4d组)、EAE免疫后第14天组(EAE14d组)和EAE免疫后第24天组(B墟24d组)，II硕士学位论文每只EAE模型组大鼠双后足垫皮下注射0．4mlGPSCH．CFA，并于免疫0h和48h内分别腹腔注射百日咳毒素400

8、ng，对照组每只大鼠双后足垫皮下注入相同剂量的免疫佐剂及生理盐水。3、对免疫动物进行持续的行为学观察、临床症状评分，所有实验数据均以均值4-标准差()‘士s)表示，采用SPSSl3．0统计软件分析。每组大鼠免疫后在相应时间点取大鼠的脑和脊髓，制成冰冻切片。对大鼠