实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑calpainⅰ表达及其临床意义

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1、实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脑CalpainⅠ表达及其临床意义【摘要】目的通过观察动物模型脑的钙蛋白酶(Calpain)Ⅰ表达的变化，探讨急性播散性脑脊髓炎的发病机制。方法①利用雌性ethod1.ToestablishEAEmodelusingfemale）是以中枢神经系统（centralnevoussystem，S）白质的急性炎症性脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病，确切病因及发病机制迄今不明［1］。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与人的ADEM临床、生化、免疫及病理等诸方面具有相同或相似的特征，目前已被国内外公认是研究ADEM的理

2、想的动物模型［2］。2006-06～2008-02本科应用急性EAE模型动态观察EAE发病过程中不同时期的CalpainⅠ表达的变化，旨在探讨EAE发病的病理生理，为临床治疗ADEM提供理论基础，为Calpain抑制剂的应用时机、治疗持续时间等提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1一般资料　　1.1材料　　1.1.1实验动物　　健康a公司；百日咳疫苗原液（BPV）：购自北京生物制品研究所。②兔抗大鼠CalpainⅠ多克隆抗体，购于Abcam公司；Sp试剂盒和DAB显色盒均购于福建迈新公司。③多聚赖氨酸溶液：Sigma公司进口分装。用

3、时蒸馏水1∶10稀释。　　1.2方法　　1.2.1完全抗原制备(EAE模型的抗原制备)　　取10只豚鼠称重后，按脑脊髓重量1g加生理盐水1mL的比例，冰浴中匀浆，再将匀浆液与等体积的完全福氏佐剂（CFA）充分混合，以无菌注射器及反复抽打制成油包水乳剂，作为抗原，4℃保存，12h内用完。　　1.2.2EAE模型制备　　取20只L/kg腹腔注射麻醉，无菌状态下以百日咳疫苗原液0.1mL/只（含2×1010个菌体）左后足背注射，以完全福氏佐剂（CFA）与豚鼠脑脊髓匀浆（GPSCH）混合液0.4mL/只四足垫注射。其中8只注射后7d做脑组织标

4、本取材，为免疫后7d组。　　1.2.3EAE模型神经功能评分　　0级：不发病；1级：尾部张力降低或轻度步态笨拙，双后肢轻度拖动；2级：尾部无张力，或中度步态笨拙，双后肢中度无力，明显拖动或姿态维持缺乏；3级：双后肢重度无力，但尚能拖动，肢体无力；4级：双后肢或四肢肢体瘫痪和尿便失禁；5级：濒死状态。　　1.2.4实验动物分组及给药　　从正常对照组中取8只；免疫后7d未发病组8只；72只中53只造模成功，选择功能评分2～4级的EAE大鼠32只，随机分4组：发病后3、7、14、21d组。　　1.2.5脑组织标本采集、组织固定及石蜡切片。　

5、　1.2.6HE染色及脑内calpainⅠ免疫组化检测（Sp法）。　　1.3图像采集与统计学分析　　各组每个时间点取8只大鼠，连续冠状切片，在相近层面（包括纹状体、额顶叶皮质、海马、侧脑室SVZ和室管膜等脑区）选取5张切片，每张切片在上述部位均选取同倍（×400）的3个不同视野，采用图像分析系统计算每个视野的免疫阳性细胞数（CalpainⅠ细胞），所有数据以均数±标准差（x±s）表示，数据统计采用spss12.0for.　　2结果　　2.1EAE模型制作鉴定　　2.1.1EAE动物模型的行为学表现　　实验组大鼠免疫后第12d出现首例发

6、病，随后陆续发病，潜伏期为（14.21±2.126）d，发病前大鼠出现体重突然下降、皮毛不光滑、食欲不振等表现，发病多以双后肢步态笨拙、活动不灵活为首发症状，后逐渐加重，出现双后肢瘫痪。发病后3～5d临床症状达高峰并持续2d左右，随后症状逐渐缓解。实验组患病率为73.6％（53/72）。对照组体重增加正常，观察到第28d均未出现EAE临床表现。　　2.1.2HE染色结果　　光镜下可见EAE组大鼠脑和脊髓组织中有大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，血管内皮细胞增生、肿胀、破坏，胶质细胞增生，炎性细胞聚集在血管周围呈典型的“袖套”样改变；脑

7、膜和脊膜也有炎性细胞浸润。对照组大鼠脑和脊髓均未见异常。　　2.2EAE时鼠脑的脑CalpainⅠ的变化　　CalpainI阳性细胞存在于胞浆中，染色成棕黄色。正常对照组大鼠脑组织中可见的CalpainI阳性细胞极少。在给予豚鼠脊髓匀浆免疫后CalpainI阳性细胞逐渐增多，在发病后7d达高峰，且染色反应增强，然后逐渐下降，21d仍高于正常，与正常对照组相比有统计学意义（P<0.05）；正常对照组CalpainI阳性细胞数与免疫后7d、发病后3、7、14、21d相比均有统计学意义（P<0.05）；发病后7d组与其它各组相比

8、均有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1各组鼠脑的脑CalpainI阳性细胞数比较（略）注：*P<0.05与正常对照组相比△P<0.05与EAE发病7d组相比　　3讨论实验性EAE是由T淋巴细胞介导