玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响

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1、玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响：王明明叶发刚葛银林【摘要】目的体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC），研究玻璃粘连蛋白（VN）在rMSC向成骨方向分化过程中的作用。方法贴壁分离培养法分离纯化rMSC，观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况，并绘制出生长曲线。选第3代细胞用以VN包被的培养板培养，每4d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成。结果经贴壁筛选法分离的rMSC生长曲线呈S形，第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结构；细胞表达CD44、CD90，而不表达CD34。用以VN包被的培养板培养12d，碱性磷酸酶染色呈阳性，硝酸银染色显示有钙结节形成。结论VN

2、有诱导rMSC向成骨方向分化的作用。【关键词】骨髓;间质干细胞；玻璃粘连蛋白;细胞分化　　［ABSTRACT］ObjectiveToisolate,purifyandcultivatetheratmesenehymalstemcells(rMSCs)invitro,andstudytheeffectofvitronectin(VN)onosteogenicdifferentiationofrMSCs.MethodsrMSCs,and3rd,4thand5thgenerationmanifestedastypicalarroesenchymalstemcells;vitronectin;

3、celldifferentiation骨髓间充质干细胞（MSC）为骨髓中一群多能干细胞，在不同的因素诱导下可以分化为不同的细胞。启动MSC分化的确切因素尚不十分清楚，周围环境中某些可溶性诱导因子已被成功鉴定，而周围不可溶性成分对成骨诱导的作用相对关注较少。本实验主要研究构成细胞外基质主要成分的玻璃粘连蛋白（VN）在MSC向成骨分化过程中的作用，以探讨MSC成骨分化的确切因素。　　1材料和方法　　1.1实验材料EM低糖培养基(GIBCO公司)，胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(SIGMA公司)，羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC（北京中山生物

4、公司）。　　1.2实验方法　　1.2.1大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）的体外分离培养　　取2月龄EM冲出骨髓，离心去除上清及脂肪，所得细胞悬液以1.0×108/L的细胞密度接种于75mL培养瓶中，在含体积分数0.15胎牛血清LDMEM完全培养液中，37℃、体积分数0.05CO2、饱和湿度条件下培养，3d后首次换液，去除未贴壁细胞。以后每2～3d换液1次，待贴壁细胞融合90%时，以2.5g/L胰蛋白酶消化、传代。贴壁细胞融合90%时即传代1次，传至第3代时进行实验。　　1.2.2rMSC的生长曲线绘制　　分别取第1、3、5、8、10代细胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化后加入LDMEM

5、完全培养液，调整细胞密度至1.0×107/L，接种于5个24孔板，每孔加细胞悬液1.0mL。每天每板取3孔消化，制成细胞悬液，混匀，计数并取平均值，连续9d，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。　　1.2.3rMSC的鉴定　　①形态学观察:在倒置显微镜下定期观察细胞生长情况。②细胞表面标志鉴定:取第3代细胞消化、计数、离心，加入200μLPBS制成细胞悬液。设置阴性对照，加入羊IgG1FITC;其他管分别加羊抗大鼠CD34FITC、CD44FITC、CD90FITC以及细胞与荧光素共轭抗体抗CD29、CD34、CD90，在黑暗中孵化15min。流式细胞仪检测细胞表面抗

6、原表达情况。　　1.2.4rMSC与VN共培养及相关指标检测　　在rMSC传代3次后，将指数生长期细胞用LDMEM调细胞的密度为3.0×103/cm2，接种于用纯化的VN包被的24孔培养板中，以成骨诱导液为阳性对照，以含体积分数0.15胎牛血清LDMEM完全培养液为阴性对照，每3d换液1次，在培养至4、8、12和16d时分别进行碱性磷酸酶染色和钙离子沉淀测定。碱性磷酸酶染色：向培养板中加入双蒸水配制的萘酚ASMX磷酸盐和FastblueRR溶液，孵育，显微镜下测定染料沉积情况。钙离子沉淀的测定：用30g/L的多聚甲醛固定细胞30min，双蒸水洗2次，暗处与50g/L的硝酸银溶液孵

7、育10min，双蒸水洗后暴露于强光下1h，计数染色细胞沉积颗粒的数目和大小。　　2结果原代培养细胞12h可见细胞贴壁，3d后大部分细胞贴壁，第1次换液后细胞4h贴壁，细胞呈多角形、菱形，可见集落形成;9～10d细胞间相互融合达90%。传代后细胞4h贴壁，生长迅速，细胞呈较为均一的梭形、多角形，并呈漩涡状排布。rMSC生长曲线呈S形，第3～5代增殖迅速，1代和8代次之，10代生长明显减慢（图1）。分离纯化的细胞不表达造血细胞表面标志CD34，而强