大鼠晶状体再生模型中干细胞样细胞及其相关信号通路的实验研究

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1、青岛大学博士学位论文大鼠晶状体再生模型中干细胞样细胞及其相关信号通路的实验研究姓名：张辉申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：谢立信20120602摘要目的：改进大鼠晶状体再生模型，观察晶状体再生过程中干细胞标志物的表达，并初步探讨Notch信号通路在晶状体干细胞样细胞增殖分化中的作用。方法：。第一部分：大鼠晶状体再生模型的改进对6-8周成年健康Wistar大鼠一眼采用透明角膜切口行晶状体囊外摘除术，术中不采用环形撕囊，而只将晶状体前囊膜做驺象限的弧形切开，分离出晶状体。术后即刻、1天、3天、1周、2

2、周、1月，分别裂隙灯下观察晶状体再生情况并照相，HE染色行病理组织学检查。第二部分：晶状体再生过程中干细胞标记物的表达及定位1．将晶状体囊外摘除术后3天、1周、2周及1月的晶状体再生组织分别取出，提取RNA并反转录为cDNA，然后通过荧光定量PCR的方法检测再生组织中干细胞标记物ABCG2、Nestin、PCNA及Telomerase的表达，确定再生晶状体组织中干细胞样细胞是否存在。设对侧未手术眼为正常对照。2．晶状体囊外摘除术后即刻，将晶状体囊袋组织分为前囊及后囊(包含赤道部)两部分，分别提取RNA并

3、通过荧光定量PCR的方法检测各部分干细胞标记物的表达，初步定位晶状体干细胞样细胞。3．石蜡包埋的大鼠眼作厚度为4微米的石蜡切片，免疫组化检测ABCG2及PCNA的表达，对晶状体干细胞样细胞进一步定位。4．晶状体囊外摘除术前3天每天两次注射BrdU，最后一次注射后行一眼的晶状体囊外摘除术，术后flPN、术后l天、3天及l周分别取眼球石蜡包埋后切片，通过免疫组化的方法检测BrdU的表达，确定增殖的细胞所在，辅助定位晶状体干细胞样细胞。第三部分：Notch信号通路与晶状体再生1．将晶状体囊外摘除术后不同时间点

4、的晶状体再生组织取出，提取RNA并反转录为cDNA，然后通过荧光定量PCR的方法检测Notch信号通路信号分子Notchl、Notch2及Ja91的表达，并且通过对细胞周期调控蛋白CyclinDl的PCR检测，初步验证此信号通路是否存在于晶状体再生过程中。2．晶状体囊外摘除术后即刻、3天及1周，将再生晶状体组织取出，分别提取组织蛋白，通过Westernblot的方法检测各部分组织中Notchl、Notch2及Jagl的表达及变化。结果：第一部分：大鼠晶状体再生模型的改进大鼠晶状体囊外摘除术后，所有手术眼

5、均很快发生晶状体组织再生，其程度随时间推移逐渐明显。至术后1月，已形成典型的再生晶状体，其中远离囊膜切开处的再生晶状体透明度高，但囊膜切开处混浊明显。晶状体囊外摘除术后即刻，仅前囊膜下及赤道部残留少量单层晶状体上皮细胞(LEC)；术后1天，赤道部残留晶状体上皮细胞开始增生。术后3天，前后囊间的囊袋内布满增生的晶状体上皮细胞，前囊切开处两断端翻折伴晶状体上皮细胞异常增生。术后1周，囊袋内开始充满早期增生的晶状体纤维，但增生的晶状体上皮细胞仍紧贴后囊膜。术后2周，晶状体前囊及赤道部的上皮细胞明显增生，囊袋内

6、的晶状纤维向前伸长呈带状，其细胞核已远离后囊膜；在前囊切开的地方，前囊弯曲皱折，细胞异常增生，前后囊贴合紧密处亦充满增生细胞，而两侧的晶状体囊袋相对完整，细胞增生分化排列规则，内侧前后囊结合处细胞增生分化类似正常晶体的赤道部，整个再生的晶状体类似葫芦状。术后1月，再生的晶状体纤维填充整个囊袋，赤道部形成典型的弓形带，与正常晶状体赤道部形态类似。而在前囊切开的部分，晶状体上皮细胞增生而无晶状体纤维形成，两侧的葫芦状再生晶状体排列规则，各自形成相对完整的前囊、赤道部以及填充囊袋的晶状体纤维。第二部分：晶状体

7、再生过程中干细胞标志物的表达及定位荧光定量PCR的方法检测到正常晶状体及术后不同时间点的再生晶状体均有组织干细胞标记物信号的存在。晶状体囊外摘除术后即刻，将前囊及包含赤道部的后囊分开分别提取RNA后行PCR检测，两部分均有干细胞标记物信号的扩增。选取四种干细胞标记物中的两种PCNA及ABCG2为代表行组织的免疫组化检测。在晶状体再生过程中，晶状体前囊及赤道部均可检测到两种信号标记的存在，特别是前囊切开的部分，晶状体上皮细胞异常增生，而此处PCNA及ABCG2的表达明显增多。腹腔注射BrdU后建模，然后通

8、过免疫组化的方法分别进行检测。结果显示，正常成熟晶状体组织中赤道部及前囊均散在少量BrdU阳性细胞，注药后1天即可检测到，术后1周仍可见。而在晶状体再生组织中，术后即刻赤道部及前囊即可见BrdU阳性细胞。术后1天，赤道部晶状体上皮细胞开始增生，BrdU阳性细胞亦开始增多，尽管前囊晶状体上皮细胞呈单层，但亦散在少量BrdU阳性细胞。术后3天，赤道部及前囊均即可见较多BrdU阳性细胞，特别是前囊切开的地方，晶状体上皮细胞异常增生，相应BrdU阳