超声作用下微泡携hgf治疗大鼠肝纤维化的实验研究

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1、温州医学院硕士学位论文超声作用下微泡携HGF治疗大鼠肝纤维化的实验研究姓名：江珍珍申请学位级别：硕士专业：影像医学与核医学指导教师：夏国园2012-05-21温州医学院硕士学位论文超声作用下微泡携HGF治疗大鼠肝纤维化的实验研究摘要目的：研究超声作用下微泡造影剂携肝细胞生长因子(HGF)对大鼠肝纤维化的治疗效果。方法：首先建立大鼠肝纤维化模型：选取清洁级雄性SD大鼠48只，适应性饲养l周，随机分为对照组(3组，共18只，正常饲养)，模型组(3组，共30只，50％CCl4联合50％山茶油以3ml／kg的剂量进行背部皮

2、下注射，每周3次，持续8周，首次注射剂量加倍)。采用探头频率为10MHz的动物超声诊断仪，分别于造模的第4、6、8周对动物行超声检查，使用3％异戊巴比妥3ml／kg腹腔注射麻醉后行胸腹部脱毛，脱毛范围为剑突下lcm为中心，约5x5cm方形区域，于超声检查结束后处死大鼠，迅速剖取肝左叶以4％多聚甲醛固定并制成蜡块。石蜡切片行HE染色观察组织病理学改变，行Masson染色观察胶原沉积情况，使用Image．ProPlus专业图像分析软件对胶原沉积面积进行定量测定并分析。构建携带HGF基因的质粒：提取胎肝总RNA，根据引物

3、设计原则，设计引物，利用RT-PCR技术扩增出肝细胞生长因子cDNA，克隆于载体pMDl8．T质粒上，将连接产物直接转化大肠埃希菌感受态细胞，采用蓝白斑筛选，挑选阳性克隆进行扩大培养，构建重组载体，经双酶切和DNA测序分析检测重组载体构建结果。超声作用下微泡携带HGF进行大鼠肝纤维化治疗：将实验大鼠随机分5组：第l组，正常对照组；第2组，模型组；第3组，低剂量组；第4组，中剂量组；第5组，高剂量组，第1组大鼠正常饲养，其余组大鼠建立肝纤维化模型。按分组对模型进行干预，通过大鼠尾静脉注射不同剂量的携基因微泡，随后使用

4、超声在各组大鼠肝区进行辐照，治疗14d后处死大鼠，取血行√嗵T检查评价肝功能，病理切片HE染色评价肝脏纤维化程度，电镜显示肝细胞超微结构改变，免疫组化SABC法观察HGF蛋白表达，Rr-PCR检测HGFmRNA表达。结果：造模过程中超声声像图：4周模型组肝实质回声细密增强，6周模型组肝实质回声增强，颗粒增粗，部分肝静脉壁变厚、毛糙；8周模型组部分肝实质回声出现宽条纹，肝包膜呈波浪状，肝边缘角变钝。病理表现：4周模型组可见肝小叶内部分温州医学院硕士学位论文肝细胞发生脂肪变性，在汇管区周围见部分纤维增生；6周模型组见中

5、央静脉周围大量成纤维细胞增生伴胶原沉积，分割正常肝小叶，但未包绕小叶形成明显假小叶结构；8周模型组见大部分肝小叶结构破坏或消失，肝细胞索排列紊乱，由汇管区和中央静脉伸出胶原条索，分割并包绕肝小叶。组间比较有显著性差异(P

6、1．O％琼脂糖凝胶电泳检测，见片段大小约2200bp左右的条带(图1)，符合HGFeDNA可读框架的大小。对重组质粒进行测序，结果显示重组质粒的碱基序列与预期结果一致，HGF编码基因已正确连接到pMDl8．T载体，成功构建肝细胞生长因子cDNA真核表达载体。治疗后血清肝功能示第3、4、5组优于第2组(尸

7、R,示第5组HGFmRNA表达增高，高于其他4组(尸<0．05)，第4组HGFmRNA表达高于前3组(尸≮0．05)，第3组HGFmRNA高于其他2组(尸<0．05)。结论：不同时期大鼠肝纤维化超声评价与病理结果相符合，超声对四氯化碳诱导肝纤维化模型的构建有较好的评价作用。超声作用下微泡携HGF可以有效抑制肝纤维进程，其治疗效果在一定范围内随着治疗剂量的增大而增强。关键词：超声；六氟化硫微泡；肝细胞生长因子；纤维化；超微结构温州医学院硕士学位论文TheExperimentalStudyofUltrasoundMic

8、robuble—mediatedHGFGeneTransferonLiverFibrosis’Ratsene1sler0nIVinAbstractObjective：Toinvestigatetheefficiencyofultrasoundmicrobuble·mediatedHGFgenetransferonliverfibrosisinrats．Met