靶向肿瘤间质纤维蛋白分子探针的制备及磁共振成像的实验研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文靶向肿瘤间质纤维蛋白分子探针的制备及磁共振成像的实验研究Experimentalstudyofthesynthesisandmagneticresonanceimagingofamolecularprobetargetingfibrinoftumorstroma课题来源：国家自然科学基金(项目编号：30870731)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员影像医学与核医学理东丽许乙凯教授梁长虹教授黄力教授李子平教授全显跃教授廖禹林教授论文评阅人梁碧玲教授郑可国教授李贵平教授2012年3月20日广州靶向肿瘤间

2、质纤维蛋白分子探针的制备及磁共振成像的实验研究博士研究生：理东丽指导教师：许乙凯教授目的摘要一、合成归巢肽CREKA并验证其对肿瘤间质纤维蛋白的靶向性，为进一步的探针制备和肿瘤靶向成像奠定基础。二、制备聚乳酸包被的超顺磁性氧化铁纳米粒SPIO．PLA和靶向性分子探针SPIO．PLA．CREKA，通过理化性质的表征及体外纤维蛋白凝块的磁共振成像实验，探讨SPIO．PLA．CREl认作为磁共振靶向对比剂的可行性。三、通过小鼠肿瘤模型的体内磁共振成像实验，评价靶向性分子探针SPIO．PLA．CREl(A对肿瘤的诊断价值。方法一、归巢肽CREKA的合成和靶向性验

3、证1、归巢肽CI也l认的合成以Wang树脂为载体，配合Fmoc氨基保护策略，固相合成五肽CREKA。第一个氨基酸与树脂的连接采用对称酸酐法，反应结束后用适量的吡啶和乙酸酐封闭树脂上剩余的活性位点。后续氨基酸以HOBt／HBTU／DIEA为缩合剂依次连接。反应完成后，以三氟乙酸为主切割试剂将目的肽段从树脂上裂解下来。合成产物经高效液相色谱分离、纯化、分析，质谱分析鉴定。l摘要2、异硫氰酸荧光素(FITC)标记CREKA在合成五肽CREKA的终末，即最后一位氨基酸半胱氨酸缩合反应完成后，用同样的方法将一个手臂氨基酸6．氨基己酸(Ahx)连接到树脂肽的氨基端。

4、通过FITC与Ahx上的氨基反应，将FITC标记在五肽CREKA的氨基端，生成终产物FITC．Ahx．CREKA。反应完成后，以三氟乙酸为主切割试剂将目的肽段从树脂上裂解下来。合成产物经高效液相色谱分离、纯化，质谱分析鉴定。3、FITC．Ahx．CREKA与血浆纤维蛋白凝块体外结合实验取人鲜血约10ml，用0．4％枸橼酸钠抗凝：2500rpm离心10min，除去血细胞，收集血浆再次离心除去剩余的血细胞，收集血浆置--80℃冰冻片刻。向血浆内加入氯化钙(CaCl2)溶液至Ca2+浓度为20mmol／L。混匀后放置于37。C恒温水浴，直到凝块形成。制备的血浆

5、蛋白凝块用磷酸盐缓冲液(PBS)反复清洗、离心，除去表面残留的各种血清蛋白。将血浆纤维蛋白凝块6等分，随机平分为两组，一组浸于FITC．Ahx—CI迮KA的PBS溶液，另一组浸于PBS中，放37℃恒温水浴30min。取出凝块，并用PBS反复清洗，离心，除去未结合的FITC．Ahx．CREKA。紫外灯照射35秒后，荧光显微镜下观察并照相。4、FITC．Ahx．CREKA与肿瘤组织切片体外结合实验取福尔马林固定的裸鼠卵巢癌移植瘤(SKOV-3)组织一块，用OTC包埋后作39m厚的冰冻切片，附贴于洁净的载玻片上，固定。固定好的SKOV-3组织冰冻切片，去离子水

6、冲洗。用FITC．Ahx．CREKA溶液孵育组织片30min，去离子水清洗3次，去除未结合的FITC．Ahx．CREKA。用紫外灯照射35秒后，荧光显微镜下观察并照相。然后将SKOV-3组织冰冻切片做HE染色。5、小鼠肾癌Renca细胞的培养和动物模型的建立小鼠肾癌Renca细胞复苏后，以DMEM完全培养基培养于细胞培养箱。在3712、5％C02条件下培养49h后，用胰蛋白酶消化，台盼蓝染色并计数，细胞存活率在98％以上。无菌选取对数生长期瘤细胞，’消化离心后弃去上清，加生Ⅱ博士学位论文理盐水洗涤，800rpm离心5min，弃上清，重复洗涤一次；生理盐水

7、调整细胞浓度至106／ml。Balb／c小鼠左侧后背部皮肤常规消毒后，将细胞悬液接种至小鼠左侧后背部皮下，每只小鼠接种O．1ml。常规饲养条件下饲养。6、FITC．Ahx．CREKA与肿瘤组织体内结合实验皮下荷Renca肾痛移植瘤Balb／c小鼠，肿瘤直径约1．0cm时，尾静脉注射FITC-Ahx-CREKA200pg／0．1ml生理盐水。6小时后处死小鼠，取肿瘤组织，一半液氮冷冻，做冰冻切片，荧光显微镜下观察并照相；另一半福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色。二、SPIO．PLA．CREKA的制备、表征和体外成像1、SPIO．PLA．CREl认纳米粒的

8、制备和表征(1)SPIO．PLA的制备将0．399FeCl2·4H20和1．08