实时荧光定量pcr在人感染猪流感诊断中的作用

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1、实时荧光定量PCR在人感染猪流感诊断中的作用彭年才12张镇西1兰邹然3黄兵3李红东2李明2苗保刚21西安交通大学生物医学分析技术与仪器研究所2西安天隆科技有限公司3山东省动物疾病预防与控制中心2009年4月30日摘要：病原检测方法及仪器是人感染猪流感防控的关键环节，针对实时荧光定量PCR分子诊断核酸检测技术的先进性以及国产试剂和仪器的成熟性，本文分析了该技术在以往禽流感检测被采用的国家标准以及使用的广泛性，最后介绍了最新发布的美国CDC《针对人感染猪流感病毒治疗和预防的临时指南》和我国卫生部《人感染猪流感预防控制技

2、术指南（试行）》，两部法规都将实时荧光定量PCR确定为人感染猪流感实验室检测的确诊方法。从以上情况可以获知：实时荧光定量PCR技术在人感染猪流感诊断中具有先进、快速、成熟、合法的特点，是一种法定的主流技术，将来实施中，国产化仪器和试剂都有保障。关键词：人感染猪流感猪流感诊断快速检测实时定量PCRReal-timeRT-PCR全球性的人感染猪流感公共卫生事件发展势头迅猛，发生国家众多，世界卫生组织29日晚已将全球流感大流行警告级别从4级提高到5级，我国也于28日召开了国务院常务会议对防控进行了部署。现在已进入关键的防

3、控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。实时荧光定量PCR技术在以往禽流感诊断中的应用众所周知，虽虽然本次人感染猪流感事件的病毒基因序列还在进一步确立当中，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行政和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量PCR方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT—PCR检测方法》、《GB/T19438.2

4、—2004H5亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法》、《GB/T19438.3—2004H7亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法》等，同时我们也注意到近年来国家针对食品安全尤其是乳品检测和食物致病菌检测的实时荧光定量PCR检测标准，如《SN/T1632.3-2005奶粉中阪崎肠杆菌检验方法：荧光PCR方法》和《SN/T1870-2007食品中致病菌检测方法：实时PCR法》。以上实时荧光定量PCR技术在禽流感及其它方面检测的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。实时荧光定量PCR技术及在我国

5、卫生应急中的应用要求实时荧光定量PCR技术（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称RealTimePCR，如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即Real-timeRT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。RealTimePCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微

6、量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。目前被普遍使用的多种常规PCR方法如各种凝胶电泳PCR法，终点荧光定量法或PCR-ELISA法叫做终点PCR法。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。普通PCR技术发明于1983年，而实时荧光定量PCR技术发明于上世纪九十年代并于1996年生产出了世界上第一台实时荧光定量PCR仪，实时荧光定量PCR技术得以实现的技术要素主要有荧光定量PCR试剂盒和实时荧光定量PCR仪，

7、我国荧光定量PCR试剂盒研发实力强大，生产厂家较多，临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量PCR诊断试剂盒很快就会面世。实时荧光定量PCR仪由于技术含量高，只有少数几家中国企业有能力生产如西安天隆科技有限公司生产的TL-988系列仪器不但取得了发明专利、国家科学技术奖、国家重点新产品证书、医疗器械注册证，而且被国家发改委确立为国家高技术产业化示范工程2008年生物医学工程专项，产品性

8、能达到国际先进水平，在乳品检测行业市场占有率比进口仪器还高[1-3]。实时荧光定量PCR仪应用广泛，1999年开始，西方发达国家尝试将PCR应用于临床传染病诊断、食品安全检测以及血液筛查，目前已相当普及。2008年12月13日中国卫生部下发《卫生应急队伍装备参考目录》（卫办应急发[2008]207号），其中要求县级以上卫生应急队伍建设中必须配备PCR仪和实时