实时荧光定量pcr的原理

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1、实时荧光定量PCR的原理(RealtimeQuantitativePCR)李越北京市理化分析测试中心11原理及重要概念2常用荧光标记物及其原理3数据分析方法和操作流程4引物和探针的设计原则2一、原理及重要概念3PCR的“雪崩效应”4PCR动力学过程和阶段5起点定量和终点定量最终产量差异明显，但起点定量比终点定量更适起始量重现性良好！合于进行定量分析研究6实时荧光定量PCR的定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后对未知模板进行定量分析的方法。7荧光定量PCR的数学原理8重要概念之——基线基线：反应荧光明显增加前的背景荧光

2、值。一般默认为3~15个循环的信号值线性图谱半对数图谱9重要概念之——阈值（thresholdcycle）在PCR扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限，通常认为是基线背景标准偏差的10倍。10重要概念之——Ct值Ct值是指PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数11荧光定量PCR的数学原理经数学理论证明，Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系12二、常用荧光标记物及其原理13荧光标记物DNA双链特异性染料序列特异性探针14常用的荧光标记物染料：SYBRGreenⅠ探针：TaqmanTaqmanMGB15SYBR

3、GreenⅠ染料SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料游离时不发光，与DNA结合后发光16SYBRGreenⅠ应用于定量检测的机理1.每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2.染料一结合，就产生荧光信号3.信号强度与DNA分子总数目成正比17探针的荧光共振能量传递（FRET）原理激发光源荧光集团淬灭基团无荧光信号产生特点：荧光集团发射光谱与淬灭基团吸收光谱重叠探针完整时：荧光集团不能发光探针不完整时：荧光集团发光18Taq酶的5’-3’的外切酶活性探针从5’端水解，荧光集团得以发光19Taqman探针应用

4、于定量检测的机理1.每产生一条DNA链，就切断一条探针2.每切断一条探针，就产生一个单位信号3.信号强度与结合探针的DNA分子数成正比20TaqmanMGB探针21TaqmanMGB探针的特点22不同荧光标记物的优缺点比较SYBRGreenⅠ：Taqman：1.成本低1.成本高2.适合初步筛选2.特异度高3.需要特别注意产物特异性3.应用于多重检测4.无法应用于多重检测4.探针设计复杂TaqmanMGB：1.背景更低2.与靶序列结合更加严谨，可以分辨1个碱基的差异3.探针长度缩短，便于设计23SYBRGreenⅠ问题结合非特异任何双链非特异产物信号不准确结果2

5、4重要概念之——融解曲线（Dissociationcurve）融解曲线是在PCR反应结束后，逐渐升高PCR反应液的温度，实时监测SYBRGreenⅠ的荧光信号强度绘制而成的。意义：PCR双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。Derivative形式(一次微分曲线）Raw形式（负一次微分曲线）25理想融解曲线（Dissociationcurve）通常使用融解曲线的负一次微分曲线进行融解曲线分析26融解曲线的设置27三、数据分析方法和操作流程28绝对定量（AbsoluteQuantitation）•将未知样品与标准曲线相比较进行分析•标准品为已

6、知绝对浓度的DNA样品拷贝数=质粒浓度×阿氏常数/109×(一个碱基对的平均分子量×质粒的总长度)（阿氏常数为6．02×1023，一个碱基对的平均分子量为648）•绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的相对定量（RelativeQuantitation）•两个或更多的基因互相进行比较•结果是一个比率表示29绝对定量之-选择标准曲线模式30绝对定量之-分析融解曲线31绝对定量之-生成标准曲线相关系数斜率•7个点以上，包含所有样本扩增范围•由倍比稀释样本而来——推荐EasyDilution32绝对定量之-获得样本定量结果通过制作标准曲线来确定样品的初始模

7、板拷贝数或浓度通常应用于微生物的定量检测及转基因食品的检测33相对定量之-选择plate模式34相对定量之-分析融解曲线35相对定量之-选择计算方法1、TheRelativeStandardCurveMethod2、ΔΔCt相对量=2-ΔΔCt目标序列和内参序列的扩增效率相等（且接近100%）ΔΔCt=实验组ΔCt（目的基因Ct值-内参基因Ct值）-对照组ΔCt（目的基因Ct值-管家基因Ct值）36相对定量之-内参基因各种条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正。管家基因通常为β-actin、GAPDH。相对定量之-获得定量结果38四、引

8、物和探针的设计原则39引物设计中的关键