模式生物斑马鱼药物依赖模型的建立以及中药的干预机制

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1、南方医科大学2009级博士学位论文模式生物斑马鱼药物依赖模型的建立以及中药的干预机制Theestablishmentofthemodelorganismzebrafishdrug·-dependentmodelandthemechanismoftraditionalJ⋯⋯·．LnlnesemeolCinetreatment课题来源：国家自然科学基金海外合作项目(No．30828033)专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员中药学陈毅飞莫志贤教授翁建霖教授梁荣能教授于荣敏教授张文清教授史珏副教授张继平教授翁建霖教

2、授莫志贤教授论文评阅人刘法锦研究员刘晓伟教授彭康教授2012年4月1日广州博士学位论文模式生物斑马鱼药物依赖模型的建立以及中药的干预机制博士研究生：陈毅飞指导教师：莫志贤教授翁建霖教授摘要背景目前，苯丙胺类中枢兴奋剂(amphetamine—typestimulants，ATS)滥用增长势头迅猛，世界五大洲21个国家的兴奋剂滥用人数已超过海洛因和可卡因滥用人数之和，呈全球蔓延之势。欧洲7个国家的一项调查表明，ATS已成为第二大类最常滥用的成瘾物质。在我国，苯丙胺类中枢兴奋剂等新型毒品滥用形势严峻，又因其严重损害中枢神经系统、心

3、血管系统等器官功能，易发生群体淫乱、人身攻击等暴力，引起社会和公共卫生问题，严重败坏社会风气，因而研制针对其依赖及其戒断症状的治疗药物意义深远。在我国中医药戒毒已经有200多年历史，积累了丰富的经验，形成了一套特有的理论和方法。中医药戒毒以扶助正气，排解烟毒为治疗思想，突出辨证论治的特色。中药疗法具有低毒价廉、药源广泛、无成瘾性等独特的优势，注重从病证出发，辨证施治，因此戒毒中药很可能在戒毒问题上取得突破性进展。大量研究结果表明中枢谷氨酸神经系统与药物依赖有着密切的联系，有关NMDA受体和AMPA受体与药物依赖的报道较多，而T

4、H作为多巴胺合成的关键酶在药物依赖形成过程中也起着十分重要的作用，但相关的报道不多。用绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)标记TH是一种新的分子生物学技术，它使TH表达的变化变得更加直观。GFP是一种能够在活细胞中表达的发光蛋白，不需要外源底物或辅助因子，在蓝光的激发下能发出绿色荧光。GFP作为荧光标l中文摘要记分子，既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。条件性位置偏爱(conditionedplacepreference，CPP)实验是一种通过测定实验动物对体验药物效应的位置是否产生偏

5、爱，从而评价药物精神依赖性潜力的有效方法。目前关于药物精神依赖的研究的实验动物，多集中啮齿类的大鼠、小鼠等，而随着越来越多样化的毒品的出现，我们需要寻找新的可用的模式生物作为传统模式生物的补充，应用于成瘾医学领域。斑马鱼作为一种新型模式动物，与大鼠、小鼠等哺乳动物相比，由于其交配行为受光周期控制、产卵量多、受精卵在体外受精、繁殖周期快、易于饲养；而且前期胚胎整体透明，易于活体观察等优点，斑马鱼在行为学中的应用前景逐渐被研究者所认识。实验目的1．拟建立成年斑马鱼的甲基苯丙胺CPP动物模型，观察成年斑马鱼CPP效应，从行为学方面来

6、评估成年斑马鱼的依赖效果，同时用中药有效成分进行干预，观察形成依赖后成年斑马鱼的行为变化。2．采用蛋白免疫印迹(Westemblotting)方法，观察甲基苯丙胺条件性位置偏爱成年斑马鱼脑内NR2B受体、GIuR2受体和TH受体表达的改变及中药活性成分钩藤总碱对其干预后是否发生变化。3．用GFP来标记多巴胺合成的关键酶圳，然后利用转基因技术培育出TH—GFP转基因斑马鱼，通过观察转基因斑马鱼幼鱼头部荧光的强弱来判断其甲基苯丙胺依赖程度，同时初步摸索对于斑马鱼幼鱼大叶钩藤水提物的有效浓度。4．证实斑马鱼是一个研究苯丙胺类兴奋剂依

7、赖的理想模型和进一步研究斑马鱼的甲基苯丙胺依赖的作用机理以及中药对其的干预机制提供实验证据。珏博士学位论文实验方法1．成年斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立：根据文献以及预实验结果可知成年斑马鱼的天然偏爱箱为褐色箱，故选择透明箱作为伴药箱。给药前用动物行为学分析系统对实验成年斑马鱼进行位置偏爱测定，剔除不符合天然偏爱习惯的动物。测定前将实验箱中间隔板抽出，当成年斑马鱼处于两个箱体之间时开始计时，逐条观察15min，以成年斑马鱼头部为准，记录成年斑马鱼在白箱中的停留时间。取经过自然位置偏爱测定合格的成年斑马鱼20条，按随机分组原则分

8、为：①正常对照组，②甲基苯丙胺模型组。d1将斑马鱼置于独立的用于训练的CPP箱，每个CPP箱的水位不低于5cm，以保证足够的水压，适应性喂养至少2d。于d3澳1]试正常状态下，所有斑马鱼的位置偏爱箱(15min内)，并且用Noldus动物行为学分析系统来跟踪其路线图(5min