河南省2009年甲型h1n1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterNeuraminidaseGeneticandPhylogeneticCharacterizationofInfluenzaA(H1N1)2009VirusByJiuzhouZhaoSupervisor：Prof．ChangguiXuePathogenBiologyCollegeofBasicMedicalScienceApril2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，

2、是本人在北京大学第一医院联合培养期间在副导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：惑九少I．J日期：矽廖年J月37日～f学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学共同所有。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借

3、阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位应该为郑州大学第一附属医院。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者-赵几汁}f171坶1：矽肛年歹,93J日摘要河南省甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析硕士研究生赵九洲导师薛长贵教授郑州大学基础医学院斌同源生物学教研室(郑州450052)流行性感冒，简称流感，是地球上分布最广、历史最悠久的一种急性

4、人畜共患传染病。其病原体为流感病毒，属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)。是一种分节状负义RNA病毒，只能于感染的宿主细胞内繁殖。神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是流感表面重要抗原物质之一，与流感病毒表面蛋白血凝素(Haemagglutinin，HA)共同为流感病毒传播致病的重要物质基础和其亚型分型的重要依据。其主要功能为促进子代病毒从宿主细胞表面释放，并阻止子代病毒的自我聚集进而感染其他细胞。而且该酶是扎那米伟Zanamivir)和奥司他韦(Oseltamivir)等主要抗流感药物的作用位

5、点。神经氨酸酶遗传进化的分析研究对流感病毒的防治有重要意义。本研究在河南省甲型HINI流感爆发的2009年10月至12月间于河南省流感哨点医院采集流感样病例毒株样本200例，经培养、分型、基因扩增和测序对得到的病毒基因样本进行比对，分析河南省甲型HINl流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的变异情况，了解其变异现状及特点。材料和方法1．流感病毒样本的采集2009年lO月至12月于河南省流感哨点医院，选择未服用抗病毒药物、发病头三天的患者采集流感样病例采集流感临床标本。制成病毒鼻咽试子，4℃条件下24h内送至实验室。2．流感病

6、毒分离培养技术2．1病毒培养用MDCK细胞制备用含10％HEPES和10％胎牛血清DMEM培养液培养MDCK细胞。于37℃，5％C02培养箱中培养。摘要2．2流感病毒分离流感病毒分离选用处于对数期生长且75％"--90％成片的MDCK细胞。lmL病毒鼻咽试子接种，用含10％HEPES和10％胎牛血清DMEN培养液，并使用终浓度为100U／mL、1001上g／mL的青、链霉素双抗。于35‘C温箱培养7天，观察细胞形态。进行红细胞凝集试验(HA)，将HA滴度小于8的毒株进行传代培养，直至滴度大于8。3病毒亚型鉴定3．1血凝

7、试验用O．75％人“o，’血细胞悬液进行血凝试验，以中国CDC提供的标准病毒样本～四川／SWLl／2009(HlNl)做阳性对照，用同体积的PBS做阴性对照。以出现凝集的最高稀释倍数为重点计数，其稀释倍数的倒数为其血凝滴度。3．2血抑实验用含4个血凝单位251上L病毒液进行血抑实验，用国家标准抗A(H1N1)、抗A(H3N2)、抗B型Yamagata系、抗B型Victoria系和抗新甲型HINl五种病毒抗体血清进行测定，以红细胞凝集出现时血清的最高稀释倍数的倒数为红细胞凝集抑制效价，当其大于等于20且仅于一种抗体血清发

8、生反应时确定为阳性。4NA基因全长引物设计采用中国国家流感中心提供的引物序列，对相应的引物库筛选，选择2对引物，预计扩增产物片段长度为引物对l：1064bp，引物对2：728bp。测序引物序列每条正反向引物Iji『面分别加上一tgtaliaacggccagt和．caggaaacagetatgacc，由上海生物工程技术有限公司合成。