禽戊型肝炎病毒中国分离株orf3蛋白抗原表位分析

《禽戊型肝炎病毒中国分离株orf3蛋白抗原表位分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、山东农业大学硕士学位论文禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白抗原表位分析姓名：胡守彬申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：周恩民20120615山东农业大学硕上学位论文中文摘要2001年，Haqshenas等从患有肝脾肿大(Hepatitis—splenomegaly,HS)综合症的鸡胆汁中首次分离和描述了禽HEV的全基因组序列。2010年，赵钦等首次分离并描述了国内禽HEV的全基因组，序列分析发现与其它国家禽HEV的同源性为77．3％一95．5％。禽HEV感染主要引起30—70周龄的蛋鸡和

2、肉种鸡的死淘率升高(1％)和产蛋率下降(20％．40％)，感染鸡通常腹部红肿，卵巢退化，偶有鸡肝脾肿大、肝坏死和出血。血清学调查发现该病毒的感染在许多国家中已广泛流行，而我国部分地区的鸡群血清阳性率也达到了30％左右。禽HEV属于肝炎病毒属，为单股正链RNA，基因组全长约6．6kb，包含三个开放阅读框：ORFl，位于基因的5’端，编码病毒的非结构蛋白；ORF2，位于基因的3’端，编码病毒衣壳蛋白；ORF3与ORF2部分重叠，对其研究很少。本研究针对禽HEVORF3蛋白，进行了整段与分段原核表达，将

3、表达获得的完整ORF3蛋白免疫小鼠，利用常规的杂交瘤细胞技术制备与筛选单抗，获得三株稳定分泌抗ORF3蛋白的杂交瘤细胞系，命名为6E9、3F3、2C9，其亚型分别为IgGl、IgG2b、IgGl，间接ELISA与Westernblot检测结果显示，三株单抗识别的抗原表位均位于ORF3蛋白C端74aa．88aa，竞争ELISA结果显示，3F3与2C9识别同一抗原表位，而6E9与前两者共享部分抗原表位。同时我们利用分段蛋白对临床存在ORF3蛋白抗体阳性的鸡血清进行了ELISA和Westernblot检

4、测。实验结果显示临床血清中存在针对1-27aa、55。74aa和74．88aa三个抗原区的抗体。而将阳性鸡血清分别与三株单抗的竞争ELISA结果显示，44％的阳性血清中存在与2C9识别同一表位的抗体。为进一步研究ORF3蛋白的不同抗原区，我们利用杆状病毒表达体系真核表达了ORF3蛋白，经SDS．PAGE分析、Westernblot和间接免疫荧光(IFA)检测，结果表明，ORF3蛋白在昆虫细胞sf9中成功获得了表达。将纯化的蛋白免疫小鼠，成功制备了ORF3蛋白的多抗血清，将该血清分别与原核表达的分段

5、蛋白进行ELISA与Westernblot反应，结果发现该血清识别的抗原位点集中在aa74．88。综合上述实验结果发现，禽HEVORF3蛋白的主要免疫显性抗原区位于蛋白C端的aa74．88位置，而1-27aa和55-74aa区域其抗原性较弱。已有研究发现，哺乳动物HEV除了ORF2蛋白含有病毒主要的抗原表位，其ORF3蛋白也含有可以刺激机体产生抗体的抗原表位，且目前ORF3蛋白已经广泛应用于哺乳禽戊型肝炎病毒中国分离株ORF3蛋白抗原表位分析动物HEV的临床抗体检测。哺乳动物HEVORF3的功能性

6、研究也已开展很久，一直是研究热点。本实验首次针对禽HEVORF3进行研究，主要针对其抗原性进行了探讨，制备的单抗有较高生物学特性具有良好的应用价值，真核表达了禽HEVORF3蛋白，具有一定的生物学功能，为进一步研究禽HEVORF3的蛋白结构和功能奠定了基础。关键词：禽HEV；ORF3基因；抗原分析2山东农业大学硕士学位论文AnalysisofORF3ProteinEpitopesofAvianHepatitisEVirusChinaIsolateAbstractIn2001，avianhepati

7、tisEvirus(HEV)wasisolatedandcharacterizedfrombilesofchickenswithhepatitis-splenomegaly(HS)syndromebyHaqshenaseta1．In2010，theChinesestrainofavianHEVwasfirstisolatedbyZhaoQinandthefulllengthsequencesofthisisolatesharedapproximately77．3％一95．5％nucleotides

8、equenceidentites诵tllthoseofotheravianHEVstrains．AvianHEVinfectioncauseshepatitis·splenomegalysyndrome，hepatonecrosis，hepatichemorrhage，regressiveovariesandupgrademortalityforchickens．AvianHEVinfectionisendemicinchickenflocksandhasspreadtoNorth