鸡病毒性呼吸道病原多重rt-pcr检测方法的建立

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1、华中农业大学硕士学位论文鸡病毒性呼吸道病原多重RT--PCR检测方法的建立姓名：姚蓉申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：毕丁仁201206鸡病毒性呼吸道病原多重RT．PCR检测方法的建立摘要鸡的呼吸道感染在养鸡生产实践中是一类极为常见的疾病。感染病原包括病毒、细菌、霉形体以及其它致病因素。大多数情况下是几种病原的混合感染或不同病原先后继发感染，致使雏鸡生长发育迟缓、成年鸡产蛋下降，可引起各种日龄鸡只的死亡。鸡新城疫(Newcastledisease，ND)、鸡传染性支气管炎(Infectiouslaryngotrache，IB)以及禽流感(Avian

2、influenza,AI)的H5、H9亚型是一类在临床上有相似呼吸道症状的病毒性传染病，均属于RNA病毒，仅根据临床症状和病理表现很难准确及时作出诊断。不同的病毒感染其后续的处置方案亦不相同，延误诊断时间或误诊均能给养鸡企业造成重大经济损失。因此，本实验拟建立ND．IB-AIH5．AIH94种禽类呼吸道病原的多重RT-PCR鉴别诊断方法，并对其特异性和敏感性进行检测，为临床上提供特异性强、敏感性高且省时省力的实验室鉴别诊断方法，其主要试验结果如下：1．4种禽类呼吸道病原扩增引物的设计和扩增方法的建立根据NDV的F基因片段，IBV的N基因片段以及AIV的H5、

3、H9亚型的HA基因片段设计引物，对四对引物分别进行梯度RT-PCR扩增，在此基础上选择合适的RT-PCR的退火温度同时对四对引物分别进行引物浓度的优化，确定普通RT-PCR的退火温度为58℃，，引物浓度为别为0．32pmol／uL(NDV)、0．32pmol／uL(IBV)、0．24pmol／uL(H5)、0．24pmol／laL(H9)。最后设计的四对引物、优化的退火温度和引物浓度能够通过普通RT-PCR技术特异性扩增NDV、IBV、AIV的H5、H9亚型的基因片段，所扩增片段长度分别为：520bp(NDV)、748bp(IBv)、151bp(H5)、26

4、6bp(H9)。2．4种禽类呼吸道病原多重RT-PCR条件的优化在普通RT-PCR的基础上对多重RT-PCR进行优化，分别从引物浓度比、Taq酶浓度、M92+浓度、dNTP浓度、退火温度这五个方面进行优化。优化的结果为M92+浓度为3．0mM，dNTP浓度为0．09U／lal，退火温度为58。C，引物浓度分别为O．32pmol／uL(NDV)、0．32pmol／laL(IBV)、0．24pmol／uL(H5)、0．24pmol／uL(H9)，优化后的结果能够很好的鉴别诊断这四种病毒以及这四种病毒的混合感染。3．4种禽类呼吸道病原多重RT-PCR方法的建立和初

5、步应用建立的每种引物均能从阳性材料中扩增出相应条带，从其它病原、阴性材料和禽类其它呼吸道病原(鸡传染性喉气管炎、鸡毒霉形体)均无特异性扩增条带；所华中农业大学2012届硕士学位论文建立的多重RT-PCR方法能够检测出10pgNDV、lngIBV、10pgAIV的H5亚型、10pgAIV的H9亚型的RNA，证明所建立的方法特异性强，灵敏度高，可用于鸡群临床上爆发呼吸道感染时的快速鉴别诊断。关键词：多重RT-PCR；NDV；IBV；AIV-H5亚型；AIV-H9亚型；II鸡病毒性呼吸道病原多重RT-PCR检测方法的建立ABSTRACTChickenrespira

6、torytractinfectionsinchickenproductionpracticeisaverycommondisease．Infectiouspathogenincludingviruses，bacteria,mycoplasma,andotherriskfactors．Mostcasesisamixtureofseveralpathogenicinfectionsordifferentpathogenshassecondaryinfection，resultinginchickgrowthretardation，adultchicken，egg

7、dropandcausethedeathofavarietyofday—oldchickens．Newcastledisease(Newcastledisease，ND)，avianinfectiousbronchitis(Infectiouslarvngotrache，IB)，aswellasavianinfluenza(Avianinfluenza,AI)H5andH9subtypesisakindofviralinfectiousdiseaseswithsimilarrespiratorysymptomsintheclinical．Andtheyare

8、RNAviruses．Accurateandtime