枣疯病植原体超低温保存探究

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1、枣疯病植原体超低温保存探究摘要：分别采用包埋玻璃化法、玻璃化法、简化玻璃化法、一般低温保存法对枣疯病愈伤组织、枣疯病组培苗茎尖及带腋芽茎段、健康婆枣组培苗茎尖及带腋芽茎段、长春花组培苗茎尖及茎段、长春花栽培苗茎尖及茎段进行了低温(-20、-76、-196°C)保存研究。结果表明，长春花只有组培苗茎尖在液氮(-196°C)中保存48h后恢复培养成功，而其他温度(-20、-76°C).其他材料均不能成功恢复培养；所有枣树材料低温保存后进行恢复培养时均死亡。关键词：枣疯病；植原体；超低温保存中图分类号：S432.4,Q-33文

2、献标识码：A文章编号:0439-8114(2013)10-2302-03枣疯病(Jujubewitche'sbroom)是由植原体(Phytoplasma)引起的一类病害，对枣树的破坏力强，具有毁灭性，使中国枣产区遭受巨大损失。枣疯病是由植物菌原体引起的果树病害，科技人员对其进行了大量研究，也取得了较明显的进展[1-4]o由于该病病原在体外培养困难且由叶蝉传病等原因，给研究枣疯病造成很大的不便。其一,植原体只能在活体寄主植物上繁殖和保藏，但枣树为落叶树种，长达5个月的休眠期(华北为11月至次年3月)和2〜3个月的病原低浓

3、度期(4〜6月)给获取毒源带来很大困难。即使是在生长和发病期间也受树龄、品种抗性、生长期和环境的影响，体内的病菌浓度波动大。其二，到目前为止，植原体的保存只能通过室内组培病苗继代培养，保存过程中可能造成菌种衰弱及丢失等，达不到长期有效保存稳定菌种的目的。研究枣疯病菌的保存技术，获得稳定的植原体菌株可为枣疯病的科学研究提供便捷条件。长春花黄化病是由植物菌原体引起的一种病害，其病原与枣疯病病原同属一种，但长春花为一种多年生草本植物，以生长快速的长春花为材料可以建立长春花-枣树菌原体感染系统，为研究枣疯病提供快捷的参照。试验也

4、对长春花的保存技术进行了探索。超低温保存是指在-80°C以下的低温中保存种质资源的一套技术。超低温保存工具主要有干冰（-79。0、超低温冰箱（-150〜-80°C）、液氮（-196°C）和液氮蒸气相（-140°C）等，其中液氮最为常用。超低温保存技术是目前惟一可行的、不需继代的生物体长期保存方式。目前使用的超低温保存方法主要有冷冻诱导脱水的超低温保存法（经典法、滴冻法、简化法等）［5-10］、玻璃化超低温保存法（预培养法、干燥法、预培养干燥法、玻璃化法、包埋脱水法、包埋玻璃化法等）［11-13］。研究采用了包埋玻璃化法超

5、低温保存、玻璃化法超低温保存、简化玻璃化法超低温保存和一般低温保存法保存对枣疯病植原体的不同携带材料进行了保存试验。1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料患枣疯病的婆枣组织培养苗（简称枣疯病组培苗）、患枣疯病的婆枣的愈伤组织（简称枣疯病愈伤组织）、健康婆枣组培苗、长春花组培苗及栽培苗。1.1.2培养基MS培养基；3号MS培养基：1/2MS+O.6mg/LZT+6mg/LNAA+15g/L蔗糖+7.5g/L琼脂。1.1.3药剂及设备蔗糖、海藻酸钠、移液管、CaC12、甘油、二甲基亚枫、乙二醇、液氮、冻存管等。1.2方法1

6、.2.1超低温保存药剂配制1）含有0.03g/mL的海藻酸钠和0.4mol/L蔗糖的无钙离子改良MS培养基I（用于枣疯病组培苗茎尖包埋）。海藻酸钠3g,蔗糖13.69g,1/10的1LMS培养基大量元素、微量元素和有机酸成分（去除CaC12）,加水定容至100mL,121°C灭菌30mine2）含有0.03g/mL的海藻酸钠和0.4mol/L蔗糖的无钙离子改良MS培养基11（用于愈伤组织包埋）。海藻酸钠3g,蔗糖13.69g,1/20的1LMS培养基大量元素、微量元素和有机酸成分（去除CaC12）,加水定容至100mL,

7、121°C灭菌30mirio3）含有0.4mol/L蔗糖的0.1mol/LCaC12水溶液。蔗糖13.69g,CaC121.11g,加水定容至100mL,121°C灭菌30mirio4）含有蔗糖的改良MS培养基I（用于枣疯病茎尖预培养）。蔗糖4.11g,3/100的ILMS培养基大量元素、微量元素和有机酸成分，琼脂0.27g,加水定容至30mL,121°C灭菌30mirio5）含有蔗糖的改良MS培养基11（用于愈伤组织预培养）。蔗糖4.11g,3/200的ILMS培养基大量元素、微量元素和有机酸成分，琼脂0・27g,加水

8、定容至30mL,121°C灭菌30mirio6）PVS2O甘油30mL.乙二醇15mL、蔗糖13.69g.水20mL,121°C灭菌30min；二甲基亚矶15mL,121°C灭菌30mirio使用前两者混合均匀。7）含有1.2mol/L蔗糖的MS培养基。蔗糖82.15g,1/5的1LMS大量元素、微量元素和有机酸成分