兔骨髓间充质干细胞向胰岛细胞分化的研究

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1、河南农业大学硕士学位论文兔骨髓间充质干细胞向胰岛细胞分化的研究姓名：何俊丹申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：王新庄201205河南农业大学2012届硕士毕业论文兔骨髓间充质干细胞向胰岛细胞分化的研究摘要骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，蹦SCs)是一类具有多向分化潜能的干细胞，有望成为未来细胞、基因治疗、组织工程技术的理想种子细胞。本研究目的在于分离纯化兔BMSCs，并研究其在体外分化为胰岛细胞的潜能，以便未来利用该类细胞作为疾病细胞和基因治疗的模型。为此，本试验利用一月龄新西兰大白兔为研究对象，较为系统全面地研究了其BMSC

2、s的分离、培养、扩增、鉴定、形态学及体外诱导分化能力，为进一步深入研究BMSCs的诱导分化和应用打下试验基础。1．应用全骨髓法分离BMSCs，根据骨BMSCs在培养瓶中贴壁生长的特点，通过传代培养来纯化已分离到的BMSCs，体外培养至第3代，获得纯度较高的BMSCs；对分离纯化的第3代兔BMSCs进行形态学观察和细胞表面特异性标志物鉴定，得出兔BMSCs表面标志CD90、CD44阳性表达，CD34阴性，进一步证实了本法所得到的纯化细胞即为兔BMSCs，为进一步的试验研究奠定基础。结论：全骨髓法能够成功分离得到纯度较高的兔BMSCs。2．采用二甲基亚砜联合高浓度葡萄糖对分离纯化的第3

3、代兔BMSCs进行体外诱导，观察诱导前后细胞形态学变化，结果试验组在诱导7d出现细胞团样集落，10d获得排列紧密的细胞团，而对照组细胞始终未见细胞团；用双硫腙染色法鉴定细胞团，结果显示，试验组为阳性；用免疫细胞化学法检测细胞内胰岛素的表达，试验组显示阳性；用ELISA法检测分泌到培养液中的胰岛素含量，结果显示，试验组7d、10d的胰岛素含量分别为(27．82±0．43)mU／L、(27．89±0．25)mU／L，与对照组的(23．39±0．20)mU／L、(25．71±0．27)mU／L比较，差异极显著(P

4、胞。3．采用含有lOng／mLbFGF、lOng／mLEGF、2o,40B27的DMEM／F-12培养液对BMSCs诱导6d，用含lOng／mLHGF、lOng／mLBTC、lOng／mL活化素A、lOmmol／L尼克酰胺、2％B27的H-DMEM培养液对BMSCs诱导6d，结果试验组BMSCs细胞收缩并相互聚集成圆型细胞团，对照组未见细胞团；经双硫腙染色，试验组显示阳性，显示试验组细胞具备胰岛细胞富含锌离子的典型特征；经免疫细胞化学染色，试验组结果为阳性，显示诱导后的BMSCs具备分泌胰岛素的能力。结果显示经本方法所诱导出细胞团细胞为胰岛细胞。结论：应用细胞生长因子联合作用能够诱

5、导BMSCs分化为胰岛细胞。4．将分离纯化的BNSCs分为7组，分别标记为a、b、c、d、e、f、g组，其中a组为对照组，自始至终用含IO％FBS的DMEM／F一12培养基进行培养；b组先用无血清、含1％DMSO的DMEM／F一12诱导3d，再用H-DM蹦培养基进行刺激培养；c、d、e、f组在b组的基础上河南农业大学2012届硕士毕业论文分别在第1、3、7、10d加入lOmmol／L的尼克酰胺；g组用只含lOmmol／L尼克酰胺的DMEM／F-12培养基进行诱导。诱导后，在b、c、d、e、f组均有胰岛细胞团出现，双硫腙染色呈阳性，g组有轻微的细胞聚团现象，双硫腙染色呈现弱阳性，a组

6、未见细胞团，双硫腙染色阴性；ELISA检测结果显示，a组胰岛素分泌量与b、c、d、e、f组均差异显著，而与g组差异不显著。结论：尼克酰胺不能独立诱导BMSCs分化为胰岛细胞，但是尼克酰胺与DMSO配合使用能够促使诱导分化的胰岛细胞分泌更多的胰岛素。关键词：骨髓间充质干细胞：二甲基亚砜：细胞生长因子；尼克酰胺：胰岛细胞：分化；兔2河南农业大学2012届硕士毕业论文THESTUDYoFRABBITBONEM[ARRoWMESENCHYMALSTEMCELLSDIFFERENT丛TION耵呵TOISLETCELLSSupervisor：Prof．WangXinzhuangMaster(P

7、h．D)Candidate：HedundanABSTI己ACTBonemarrowmesenchymalstemceils(BMSCs)isakindofmultiplexdifferentiationpotentialofstemcells．Itoriginatesfrommesoblast，residesmainlyinmammalianbonemarrow，andcoexistswithhematopoieticstemeells(HSCs)．BMSCsnoto