兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的研究

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河南农业大学学术硕士学位论文题目兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的研究学位申请人姓名陈晓佩导师姓名王新庄学科专业临床兽医学研究方向动物细胞工程中国郑州年月 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目：兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的研究英文题目：THESTUDYOFTHEDIFFERENTIATIONOFRABBITBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSINTOINTOISLETCELLS学位申请人：陈晓佩导师：王新庄教授专业：临床兽医学研究方向：动物细胞工程论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学２刖５届顾±研巧生论文：挪南农业大学学位论文独创性声明、便用授权及知识产权归属承诺书￣妾位论兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为膜ＩＩ文题目岛细胞硕±类别￣￣：Ｍ陈晓佩Ｉ学矛斗临床兽医学专业王新庄学位ｉ仑文否如需保密，解密时间年月曰独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加，ｔｕ标注和致谢的地方外文中不包含其他人己经发表或撰写过的研巧成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材一料，指导教师对此进行了审定。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。特此声明。於歌研巧生签名：萍导师签名；专叫＂曰期：占月曰曰期：２〇化年ｊＭ：年＾月ｉ曰学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，＾并提供日录检索和阅览服务，可式采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离一开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第署名单位为业河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农大学所有，否则，承担相应的法律责任。注研：保密学位讫文在解密后适用于本授权书。究生签名：蘇私瓜导师签名：ｍｍｍｍｒ．＂■■ｌ曰期：其＆＾長月］曰曰期《月曰曰期：斯弁／月曰３ 本研究由863高新技术项目(编号：2008AA101010)河南省基础与前沿技术研究计划（编号：092300410081）河南农业大学人才引进基金提供资助 致谢岁月如梭，三年的求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔仍历历在目。值此论文完成之际，谨向所有关心、爱护、帮助过我的人们表示诚挚的感谢和美好的祝福。三年的学习生涯离不开我敬爱的导师——王新庄教授的悉心指导与帮助！生活方面：王老师一直把我们当做自己的孩子，给予了无微不至的关怀；学业方面：一直以深厚的专业素养指导教育我们；做人方面：他那豁达睿智深深地感染我，丰富的人生经历和低调的处事原则都给我的学习生活带来了潜移默化的指导。无论是生活、学业，还是做人态度方面，王老师都给予我了极大的关怀和帮助，这将成为我人生道路上的宝贵财富。衷心感谢邓立新老师所在实验室为我的学习和实验过程提供帮助。感谢临床兽医学科的贺秀媛老师、仝宗喜老师、张志平老师、董海聚老师、张君涛老师、刘芳老师等在我读研阶段给予的指导和帮助。论文的完成离不开实验室人员的团结协作，感谢师姐许晓婷、蒋金航、吕婧玉，师兄翟明胜、石凯文及同学王绿林、黄淑成、张先磊，感谢师妹王亚丹、张宁，师弟于文浩、刘远哲，感谢你们无私的帮助，让我经历了一段美好的研究生生活。2015年4月 目录摘要...................................................................................................................................................1文献综述...........................................................................................................................................31骨髓间充质干细胞的研究进展....................................................................................................41.1BMSCs的发现和分布.......................................................................................................41.2BMSCs的生物学特性.......................................................................................................41.3BMSCs的分离方法...........................................................................................................51.4BMSCs定向分化的机制...................................................................................................51.5BMSCs的应用前景...........................................................................................................62BMSCs向胰岛细胞分化的研究进展..........................................................................................72.1BMSCs向胰岛细胞定向诱导分化方法的研究...............................................................72.1.1诱导剂法..................................................................................................................72.1.2转录因子调控法......................................................................................................82.1.3共培养法..................................................................................................................92.2BMSCs胰岛样分化在临床上的应用...............................................................................9试验一不同分离方法及首次换液时间对兔骨髓间充质...........................................................10干细胞生物活性的影响.................................................................................................................10引言.........................................................................................................................................101材料与方法..................................................................................................................................101.1试验材料...........................................................................................................................101.1.2主要试剂................................................................................................................101.1.3主要仪器与器材....................................................................................................101.2试剂的配制.......................................................................................................................111.2.1PBS缓冲液配制....................................................................................................111.2.20.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液..................................................................111.2.3双抗配制...............................................................................................................111.2.4FBS的冻融............................................................................................................111.2.5DMEM/F-12完全培养基......................................................................................111.2.6台盼蓝染色液........................................................................................................111.3试验方法...........................................................................................................................121.3.1BMSCs的提取......................................................................................................121.3.2全骨髓贴壁法........................................................................................................121.3.3红细胞裂解法.......................................................................................................12 1.3.4兔BMSCs细胞活性检测....................................................................................121.3.5兔BMSCs生长曲线的绘制................................................................................121.3.6首次换液时间对兔BMSCs的影响....................................................................131.3.7细胞免疫组化鉴定兔BMSCs.............................................................................131.3.8统计学处理...........................................................................................................132结果与分析.................................................................................................................................132.1不同分离方法对兔BMSCs形态和生长的影响...........................................................132.2兔BMSCs生长曲线绘制...............................................................................................152.3兔BMSCs的鉴定...........................................................................................................152.4首次换液时间对兔BMSCs培养周期的影响...............................................................163讨论.............................................................................................................................................164、小结...........................................................................................................................................17试验二兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的动态变化的研究...........................18引言.............................................................................................................................................191材料.............................................................................................................................................191.1试验材料...........................................................................................................................191.1.1试验对象................................................................................................................191.1.2主要试剂................................................................................................................191.1.3主要仪器与器械...................................................................................................201.2主要试剂配制...................................................................................................................201.2.1生长因子（bFGF，EGF，activin-A，HGF）配制为1µg/mL..........................201.2.2配制1mol/LHEPES..............................................................................................201.2.3不同浓度（0.23mol/L，0.175mol/L，0.111mol/L）葡萄糖的配制.................201.2.4第一阶段的诱导剂...............................................................................................201.2.5第二阶段的诱导剂...............................................................................................211.2.6第三阶段的诱导剂...............................................................................................211.2.7双硫腙染色剂.......................................................................................................211.2.80.2％TritonX-100................................................................................................211.2.9DAB显色液.......................................................................................................212试验方法......................................................................................................................................212.1体外定向诱导分化...........................................................................................................212.2双硫腙染色.......................................................................................................................222.3RT-PCR检测胰岛细胞特异性基因的表达.....................................................................22 2.3.1细胞总RNA的提取.............................................................................................222.3.2反转录合成cDNA................................................................................................222.3.3PCR反应................................................................................................................232.3.4琼脂糖凝胶电泳....................................................................................................242.4免疫组织化学染色..........................................................................................................242.5ELISA检测......................................................................................................................242.6数据处理...........................................................................................................................243结果与分析..................................................................................................................................253.1诱导分化过程中细胞的形态学变化...............................................................................253.2DTZ染色鉴定结果..........................................................................................................263.3RT-PCR检测胰岛细胞特异性基因表达.........................................................................263.4免疫细胞化学检测结果..................................................................................................273.5ELISA检测结果..............................................................................................................284讨论..............................................................................................................................................285小结..............................................................................................................................................30结论...............................................................................................................................................31参考文献.........................................................................................................................................32英文缩写词表.................................................................................................................................41ABSTACT.......................................................................................................................................42 兔骨髓间充质干细胞体外定向分化为胰岛β细胞的研究摘要【目的】本试验通过在体外添加不同生长因子，拟探索稳定高效的体外诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛β细胞的诱导体系，为进一步进行深入研究及临床实践中应用干细胞移植治疗糖尿病奠定试验基础及临床指导意义。【方法】分别采用全骨髓贴壁法和红细胞裂解法体外分离获取兔骨髓间充质干细胞（BM-MSCs），倒置显微镜观察细胞形态、采用台盼蓝染色法检测细胞活性、记录两种分离方法首次达到传代的时间、细胞免疫组化法鉴定CD90、CD44、CD34表面抗原的表达；分别在原代培养12h、24h、48h、72h时首次换液，以后每3d换液一次，记录各组各代培养时间及培养总周期，筛选出最佳首次换液时间；取生长良好的P3代细胞，采用添加体外生长因子三步法，分阶段将兔BMSCs体外诱导为胰岛细胞，第一阶段用含有10ng/mLbFGF、1%DMSO、1%FBS、23mmol/LGlucose的H-DMEM培养液对BMSCs诱导3d，第二阶段用含有10ng/mLbFGF、10ng/mLEGF、2％B27、10mmol/L尼克酰胺、17.5mmol/LGlucose的无血清DMEM/F-12培养液对BMSCs诱导8d，第三阶段用含有10mmol/LHEPES、10mmol/L尼克酰胺，2nmol/L的activin-A，11.1mmol/LGlucose的RPMI1640培养液对兔BMSCs诱导8d，倒置显微镜下观察其形态学变化；双硫腙染色鉴定细胞团；胰岛细胞特异性基因(Pdx-1、Insulin、Nkx6.1)的表达用RT-PCR方法检测；免疫细胞化学法检测特异性蛋白（胰岛素蛋白）的表达；ELISA检测胰岛素分泌的情况。【结果】两种分离方法均能获得较均一的长梭形细胞，所培养细胞CD90、CD44抗原阳性表达，CD34抗原阴性表达。其中红细胞裂解法所得细胞活性较全骨髓贴壁法高，首次传代时间短，差异显著（P<0.05）；24h首次换液各代达传代时间所需时间与其他各组比较差异极显著（P<0.01），为最佳首次换液时间，可显著缩短细胞培养周期；第一阶段诱导末（3d），细胞形态无明显变化，部分细胞变圆，双硫腙染色不着色，RT-PCR未检测到任何特异性基因的表达；诱导第7d时，细胞逐渐融合，细胞簇增多，直径变大，双硫腙染色细胞团呈棕红色，仅检测到PDX-1基因的表达，证实其为胰岛前体细胞；第二阶段诱导末（11d），细胞簇数目增多，细胞边缘突起，检测到PDX-1、Insulin的表达；第三阶段诱导末，细胞团状物与周围组织分离，形成类胰岛样结构，双硫腙染色细胞呈红棕色，PDX-1、Insulin、Nkx6.1基因均表达；免疫细胞化学法检测细胞内胰岛素蛋白的表达，试验组细胞胞浆内出现大量棕黄色颗粒，结果呈阳性反应，对照组细胞胞浆内未出现棕黄色颗粒，结果呈阴性反应；诱导3、7、11、15、19d的胰岛素分泌量分别为（27.86±0.034µIU/mL）、（29.33±0.48µIU/mL）、（29.92±0.46µIU/mL）、（31.32±0.03µIU/mL），1 与对照组（20.54±0.21µIU/mL）、（22.10±0.45µIU/mL）、（22.36±0.35µIU/mL）、（23.39±0.20µIU/mL），3d时诱导组与对照组相比差异不显著，因为此时未出现细胞团样变化，未分泌胰岛素，7d、11d、19d差异均显著（P<0.05）。【结论】采用红细胞裂解液法，24h首次换液能够明显缩短骨髓间充质干细胞的培养周期，所得细胞生长增值能力强、纯度高、生物学特性稳定，具有多向分化能力；在体外采用生长因子三阶段诱导法，能够诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成熟的具有功能性的胰岛β细胞。【关键词】骨髓间充质干细胞；红细胞裂解液法；全骨髓贴壁法；生长因子；胰岛β细胞；诱导分化；兔2 文献综述糖尿病是对人类健康构成严重威胁的一类全球性代谢疾病，主要包括I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病是自身免疫系统破坏胰岛胰腺细胞，从而导致胰岛素分泌不足，又[1，2]称青年型糖尿病。II型糖尿病的主要特征是胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷，随着对糖尿病研究的不断深入，学者们发现II型糖尿病的发病机制与胰岛β细胞的凋亡密切相关，因[3]此外源性胰岛素注射也通常用于治疗II型糖尿病。目前，临床上治疗糖尿病主要采用注射胰岛素的方法，此种方法虽然可以降低血糖及延缓糖尿病患者各种并发症的发生，却不[4]从根本上治疗患者。随着科技的不断发展及进步，人们对糖尿病的发病机制了解的更加深入了，胰腺或胰岛移植在临床上用来治疗糖尿病，让糖尿病患者看到了希望。Shapiro研究小组的临床实验结果发现，人通过胰岛移植后，可以在很大程度上降低1型糖尿病患者对外源注射胰岛素的依赖，然而由于供体的缺乏和长期的免疫排异反应大大制约了这项[5，技术在临床上的发展，因此找到新治疗糖尿病的细胞来源成为世界各国学者的研究热点6]。近年来研究表明，随着干细胞研究的不断深入，人类多能性胚胎干细胞和成体干细胞相继成为治疗糖尿病的一个新的潜在的细胞来源，尤其是今年小鼠胚胎干细胞体外诱导成[7，8，9]功的产生对葡糖糖刺激敏感的胰岛分泌细胞，使干细胞治疗糖尿病成为可能。干细胞是一类可向任何来源于外胚层、中胚层和內胚层的细胞分化的具有自我更新能力的多潜能细胞，主要包括胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）、成体干细胞（adult[10，11]stemcell，ASC）和诱导多能性干细胞。胚胎干细胞具有分化为体内任何一种细胞类型的能力，但这种分化是“非定位的”，目前，尚不能控制胚胎干细胞在特定的部位分化成相应的细胞，容易导致畸胎瘤，并且由于其伦理问题、免疫排斥等问题限制了其临床应用[12，13]。成体干细胞相对于胚胎干细胞的全能性而言，只是一种尚未完全分化的分布在成体组织中的多潜能干细胞。从患者自身获得的成体干细胞不具有组织相容性，可避免胚胎干细胞及胰岛胰腺移植带来的伦理道德问题、免疫排斥问题及细胞来源短缺问题等。此外，成体干细胞在不同的外界诱导条件及特殊信号刺激下，除了向该组织分化外，还可重新编[14，15]码，分化为其他的类型的细胞。因此成体干细胞成为细胞治疗最有吸引力的来源。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs)是成体干细胞的一类，具有多向分化潜能，除了向来源于中胚层的细胞分化外，还可在特定条件下向外胚层、內胚层的细胞组织分化。目前，BMSCs在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得[16，17，18]了重大突破，并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。近年的研究表明，在一定诱导条件下BM-MSCs具有跨胚层分化为来源于内胚层的胰岛细胞的潜能，并且表观遗传学调控在其分化过程扮演重要角色[19，20]。此外，BM-MSCs不仅具有取材方便、体外易分离扩增、连续传代后细胞活性好、3 且在宿主体内长期存活的优势，而且利用自体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病患者，既可以解决胰岛移植供体不足的问题，又可以避免移植排斥反应，因此BM-MSCs成为治疗糖尿病的理想干细胞来源。1骨髓间充质干细胞的研究进展1.1BMSCs的发现和分布Cohnheim，一位德国科学家，最早在1867年发现骨髓中有一种非造血干细胞的细胞存在，将此细胞称为非造血干细胞，但是人们并没有对骨髓中的这种非造血干细胞进行进[21]一步的深入研究，主要是由于知识水平有限及试验条件贫瘠。直到1976年，Freidenstein和他的同事首次发现有一些长梭形的细胞集落存在于骨髓中，在体外培养这些细胞时，发现其呈贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，但是并未对此细胞进行命名。1984年，Owen将这种形态类似成纤维细胞的额细胞集落称为成纤维样集落形成单位（colonyformingunits[22]fibroblastic,CFU-F），在此基础上，Caplan等在1991年将其命名为骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs）。骨髓间充质干细胞主要分布在骨髓、脂肪、组织、外周血、胎儿血液、肝脏等，其中骨髓组织含量最为丰富。1.2BMSCs的生物学特性间充质干细胞最早在骨髓中发现，是来源于发育早期的中胚层和外胚层的成体干细胞的[23、24][25][26]重要成员。间充质干细胞在特定的诱导条件下，可分化为脂肪、成骨、软骨、神[27][28][39][30][31]经、内皮、肝、心肌、肌肉、肌腱、韧带等多种组织细胞。间充质干细胞易于体外分离培养，扩增迅速，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，并且其免疫源[32]性低、能在宿主体内长期存活，能有效避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗涉及的伦理道德、免疫排斥等问题，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛[33]进行研究。BMSCs在体外培养时呈集落样贴壁生长，形态上呈现梭形的纤维状或不规则样，电镜下观察，大部分BMSCs细胞核呈椭圆形，细胞胞浆丰富，核仁明显，细胞聚集生长为均匀的旋涡状群落。对细胞周期的研究显示，体外培养BMSCs有90%处于G0/G1期，约10%[34,35]处于复制期，说明其具有很高的分化潜能和很强的增殖能力。体外培养的BMSCs其生长曲线呈典型的“S”型曲线，1~2d时处于平台期，细胞增值缓慢，3~5d以后进入的对数生长期，细胞开始大量增殖，之后进入平台期。BMSCs可在体外大量扩增和长期培养，冷冻保存后仍保持其未分化状态。4 BMSCs属混杂细胞群，目前还没有发现特异性的表面标记物，其鉴定尚无统一标准。BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达内皮细胞、间质细胞、表皮细胞和肌肉细胞的表面标志，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整合素[36.37,38]家族成员CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等。不表达CD34、CD45、CD11b、[39,40]CD11a等造血干细胞表面标志。1.3BMSCs的分离方法[41]BMSCs在骨髓中所占比例一般为0.001%~0.01%，含量特别低并且随着年龄的增长，其数量和生长能力明显降低，很难满足临床应用，因此，必须在体外大量培养和扩增。全骨髓贴壁法、红细胞裂解法、密度密度梯度法、免疫磁珠分选法和流式细胞术分选法是目前常用的分离纯化BMSCs的有效手段。全骨髓贴壁法：其原理是由于不同细胞对培养介质表面的贴壁能力不同，通过定期更换细胞培养液可去除不贴壁的细胞，从而达到纯化BMSCs的目的。这种方法是1987年由[42]Friedenstein建立的，此种方法虽操作简单，但保留了造血干细胞和其它杂细胞，在体外培养过程中混杂的细胞会与BMSCs竞争生长空间及营养成分，从而影响目的细胞的生长及贴壁，导致其纯度不高。红细胞裂解法：红细胞裂解液的有效成分是氯化铵，能够利用红细胞的渗透脆性特异性的破坏无核红细胞膜而去除红细胞和血小板，并且对有核细胞无影响，从而去除骨髓中含量最高的细胞成分，经红细胞裂解液处理后，减小杂细胞对其贴壁的影响，为BMSCs[43]贴壁保留了空间，有利于BMSCs的早期贴壁，所得细胞纯度较高，且细胞活力不受影响。密度梯度离心法：最常用的是1.073g/mlPercoll或Ficoll裂解液，利用BMSCs与其他细胞密度不同，提取单核细胞进行贴壁培养，此种方法所获得的细胞纯度较低，但细胞分化能力好。密度梯度法由于分离液往往对BMSCs有一定的损伤，且离心会丢失大量的细[44]胞，对细胞活性有影响，因此应用受到很大限制。流式细胞术分选法：由于骨髓BMSCs体积小，与其他细胞相比相对缺少颗粒，可利用流式细胞仪能够分选纯度>95%的细胞亚群，此种方法筛选BMSCs的分选效率和纯度均较高，但是对实验条件和设备要求较高，费用昂贵，并且BMSCs表面缺乏特异性标志，[45]在具体操作过程中可造成细胞的损伤和死亡，所以较少使用。1.4BMSCs定向分化的机制越来越多的证据表明，无论在体内还是体外，BMSCs均具有较强的可塑性，不仅可以分化为脂肪细胞、肌肉细胞、成骨细胞等各种间质组织细胞，还可跨越胚层分化为外胚层的神经细胞及內胚层的肝细胞等。近年来，关于BMSCs体外定向分化的报道屡见不鲜，大部分观点认为成体干细胞的分化与微环境密切相关，干细胞进入新的微环境之后，对正在进行分化的细胞的分化信号做出调节反应，根据自身所接受的刺激信号进而发生横分化5 或去分化，形成不同类型的组织细胞。目前关于干细胞定向分化的机制主要有一下观点：（1）干细胞横向转化学说：干细胞的横向转化是指某种干细胞或组织特异性细胞通过横分化/去分化产生的一种更原始更多能的细胞（即前体细胞），然后经过新的途径再纵向的分化为其他细胞。从经典的发育生物学角度讲，只有胚胎干细胞（ES）具有全能性，可跨胚层分化产生各类型的细胞，而成体干细胞只能向其所在胚层的细胞分化，不能跨胚层或跨系分化，而MSCs可塑性的发现对先前观点提出了质疑。最早大部分学者认为跨胚层或跨系分化的基础是干细胞的“横分化”及“去分化”现象。干细胞所处的微环境对干细胞分化具有重要的调控作用，当干细胞进入新的微环境后，对分化信号的反应受到周围正在分化细胞的影响，从而刺激MSCs获得新的表型，可表现出可塑性。同时，由于细胞对原有环境保持记忆，因此这种转化需要特定的条件，即BMSCs横向分化出的细胞类型受到化学物质、细胞因子、基质细胞、激素等的影响，其中细胞因子的作用尤为重要，添加不同的细胞因子可使MSCs分化为不同的细胞类型。此外，在分子水平上，MSCs横向分化一[46，47]定伴随着关键发育基因表达的改变，如Dennis等认为，MSCs分化发育的不同阶段，基因表达会发生变化，有选择地激活或抑制相关转录因子，启动相关基因，从而出现特定的转绿和翻译水平调控，从而是MSCs向特定成体细胞分化。（2）细胞融合假说:干细胞与其所处的微环境中的成熟细胞发生融合从而表现出其他细胞的生物学特性。融合后的细胞中染色体数量是正常细胞的2倍，随后融合的细胞发生减数[48][49]分裂，从而成为有正常数量染色体的细胞。Terada等和Ying等的研究表明在体外共同培养时，ESC可以自发与神经或HSC细胞融合，从而诱导神经干细胞（Neuralstemcell，NSC）或造血干细胞（HSCs）“横向分化”为胚胎样干细胞，融合的HSCs和NSC均继承了ES[50]细胞的表型特征。Mezey等研究发现，源自BMSCs的肝细胞主要通过HSC和肝母细胞的[51]融合来实现的。Wang等进行了一系列骨髓移植重建肝脏的实验,结果发现，移植前供体细胞独有的等位基因为纯合子，而重建的受体肝脏细胞为杂合子，通过细胞遗传学分析显示从雌鼠供体骨髓移植重建的雄鼠受体肝细胞核型为80，XXXY(-倍体和二倍体的融合)和120，xxxxYY(-倍体和四倍体的融合)核型，证实重建肝细胞是供体和受体细胞融合分化而来，移植的成体干细胞可能通过与体内原位组织细胞融合并表达出靶细胞的表型。1.5BMSCs的应用前景近几年来，干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最引人注目的领域，该领域的的迅猛发展必将给疾病治疗和生物医学领域带来深刻的变革。干细胞是尚未分化发育的，是具有自我复制的多潜能细胞，在一定的条件的下，干细胞可分化形成机体的任何类型的组织和器官，对组织器官的修复与替代具有极其深远的影响。干细胞不仅可用于细胞治疗，也可用于新药的开发、毒理药理的研究、基因功能研究等。由于BMSCs具有取材方便，能[53]快速体外扩增，同种异体移植或异种移植免疫排斥反应弱，多次传代仍有分化能力，易于转染，无伦理道德问题等优势，成为细胞治疗或基因治疗最有优势的种子细胞，在创伤6 修复、组织或器官重建、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤、抗肿瘤等方面具有广阔的应用前景。BMSCs具有归巢性，可以向多种组织迁移、定位并分化为相应的组织细胞促进成体组[54,55][56]织再生。1998年，Ferrari等将带有lacZ基因小鼠的骨髓移植给胫骨损伤的的免疫缺陷小鼠，移植2~3周后取小鼠的骨骼肌和心肌检测，发现β-半乳糖苷酶阳性细胞数明显超[57]过肌卫星细胞数，说明MSCs参与肌肉的再生过程。Young等表明MSC联合Ⅰ型胶原可明显改善兔跟腱缺损模型。将MSCs体外诱导为心肌细胞，将其移植缺血损伤的心肌，[58，59][60]可显著缩小心肌梗死面积，减少疤痕组织的形成，可重建心肌。Bayes-Genis等将[61]MSCs移植给接受心脏移植手术的患者，在证实MSCs可分化成心肌样细胞。在Lu等建立的脑创伤模型中，尾静脉途径输注MSC，观察神经功能的指标的恢复情况发现MSC迁[62]移到受损大脑的实质，实验组运动的神经功能受损情况明显好转。Kopen等将MSC注人新生小鼠的侧脑室，发现MSCs迁移遍及整个前脑和小脑，在纹状体和海马，MSCs表达GFAP。提示其已经分化为星形胶质细胞；在嗅觉小岛、嗅球、小脑的内颗粒层发现大量的[63]MSCs。Morigi等的研究表明，MSCs可促进急性肾功能损害模型大鼠的肾功能修复。最近几年，虽然在BMSCs的生物特性和临床应用方面取得了很大的进展，但是仍有很多问题尚未解决：（1）目前仍没有发现MSCs高特异性的表面分子标志，还没有鉴定BMSCs的统一标志，目前大多数方法是以培养过程中出现的形态学变化及免疫细胞化学特性为依[64]据来鉴定，获得的BMSCs多位具有各种分化能力的混杂细胞，难以得到高纯度的BMSCs的群体。（2）BMSCs定向分化的条件还不清楚，诱导效率低，虽然已经报道很多定向诱导MSCs分化为特定组织细胞的细胞因子，但这些细胞因子的作用机制尚不太清楚。（3）BMSCs分化调控的分子机制仍不明确，有研究表明细胞微环境可以促进BMSCs向特定方向分化。解决这些问题需要对BMSCs进行更深入的研究，然而，最终实现临床应用还需要进行大量的基础和临床研究。2BMSCs向胰岛细胞分化的研究进展目前，对于糖尿病患者来说，最有效的治疗方法是进行胰岛细胞或胰腺移植，但是存在供体缺乏以及终生服用免疫抑制剂的问题。近几年，国内外学者研究表明，通过创造适宜的微环境，骨髓间充质干细胞（BMSCs）可在体内体外横向诱导分化为胰岛分泌细胞，通过自体移植可避免供体缺乏和免疫排斥两大难题，利用干细胞已成为临床研究治疗糖尿病的焦点。2.1BMSCs向胰岛细胞定向诱导分化方法的研究2.1.1诱导剂法[65]Schudiner等研究发现，胰腺组织与神经组织有相似的生长发育机制，神经生长因子[66]是胰腺发育的关键因素。碱性成纤维因子（bFEF）和表皮生长因子（EGF）是一种神经生长因子和一种多功能的生长因子，均具有扩增神经干细胞的功能，在体内外刺激内皮细胞、7 间充质干细胞生长，通过激发细胞内PDX-1表达启动胰岛细胞分化。β-巯基乙醇（β-BME）是一种常用的还原剂，可改变细胞的氧化状态，显著促进细胞生长，保护细胞存活。尼克酰胺（NIC）在诱导分化过程中可促进胰岛细胞聚集和再生，并增加β细胞的数量和促进β细[67]胞分化后的成熟。活化素A、肝细胞生长因子（HGF）等细胞因子可促进胰岛细胞的释放，促进β细胞的分化。[68]Sun等通过三步诱导法将MSCs体外诱导为胰岛分泌细胞，第一步用无血清的含有β-巯基乙醇的高糖诱导2d；第二步用含非必需氨基酸、β-成纤维细胞、bFEF、EGF、B27、谷氨酰胺的培养液诱导8d；第三步用活化素A、尼克酰胺、β-成纤维细胞的培养液诱导8d，通过三步法获得胰岛样分泌细胞，双硫腙染色和免疫组织化学法检测胰岛素分泌均为阳性。[69]李艳华等人用含10ng/mLbFGF、10ng/mLEGF、2％B27的IMDM培养液对BMSCs进行第一阶段诱导，用含有β细胞调节素10ng/mLβ细胞调节素、10ng/mL肝细胞生长因子、10ng/mL活化素A、2％B27、10mmol/L尼克酰胺的的IMDM培养液对BMSCs进行第二阶段诱导，经两步法成功的将MSCs诱导分化为胰岛样细胞团，RT-PCR检测表达ngn3、IPF-1、Insulin和胰高血糖素基因，双硫腙染色阳性，免疫组织化学检测胰岛素、胰高血糖素呈阳性[70]表达。Oh等采用含有1%DMSO的无血清培养液诱导3d，后用含10%FBS低糖培养液诱导10d，成功的大鼠间充质干细胞诱导为胰岛素分泌细胞。2.1.2转录因子调控法胰腺的正常发育和功能的维持需要依赖大量的转录因子，通过模拟β细胞发育过程，将外源性胰腺发育和功能的相关基因导入间充质干细胞内，使其分泌胰岛素。这些转录因子包括胰腺十二指肠同源盒1（pancreaticandduodenalhomeoboxfactor-1,Pdx-1）、配对盒基因4（pairedboxgene4,Pax4）、神经元素3（neurogenin3，Ngn3）和Nk同源异形盒基因家族6.1（Nk6transcriptionfactorrelatedlocus1，Nkx6.1）、Nk2转录因子相关2（NkX2transcriptionfactorrelated2,Nkx2.2）等，它们特异地表达于胰岛组织，这些转录因子的协调表达决定胰[71,72]岛β细胞的分化Pdx-1是一种同源转录因子，在胰腺发育过程中起着重要的作用。Pdx-1参与胰腺的发育、成熟及胰岛细胞的分化、成熟和增殖，Pdx-1基因的活化可促进胰岛素的释放及β细胞[73,74][75]相关基因的表达，是胰腺开始形成的标志。Li等将携带PDX-1基因的反转录病毒转染人BMSCs，检测到转染细胞表达多种胰岛发育和功能相关的基因。Ngn3调控早期胰腺发[76,77]育，能启动胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞，在成熟胰岛中不存在。研究证实，敲[78]除小鼠的Ngn3基因，其不表达任何胰腺前体细胞和内分泌细胞。Yang等报道，在Ngn3表达的内分泌前体细胞增加单一外源性Pdx-1的表达能使得胚胎发育阶段的α细胞转化为β细胞。Pdx-4可以促进内分泌前体细胞、成熟α细胞的生成，以及向β细胞的分化。研究表[79]明，Pdx-4/Pdx-6基因双重敲除后，小鼠无成熟内分泌细胞。Blyszczuk等将Pdx-4转入小鼠胚胎干细胞，获得拟胚体，按nestin阳性细胞选择方法，成功的将EBs诱导为胰岛素分泌8 细胞。Nkx6.1和Nkx2.2是早期胰腺上皮的标志物，两者在胚胎发育过程中对β细胞的分化[80,81]是必不可少的。敲除Nkx6.1和Nkx2.2，小鼠β细胞几乎缺失，小鼠因糖尿病而死。干[82]扰Nkx6.1mRNA过表达会抑制大鼠主要胰岛的表达，胰岛素分泌下降。2.1.3共培养法[83]细胞微环境可以促进MSCs向特定方向分化，通过模拟细胞生存的微环境，Choi等用受损的胰腺研磨上清液与兔MSCs共培养，成功的诱导MSCs分化为胰岛素样细胞团，其表[84]达胰岛素、胰高血糖素、胰多肽和生长抑制素4种胰腺内分泌激素。沈浩亮等利用Transwell培养体系，将MSCs与纯化的胰岛细胞共培养，发现MSCs可分泌大量胰岛素，免疫荧光检[85]测胰岛素呈阳性反应。Kanitkar等将大鼠胰腺细胞与MSCs共培养后，经腹腔注射到糖尿病大鼠体内，发现试验组血胰岛素水平得到控制。在特定的微环境中，干细胞通过与各种细胞因子、激素、细胞基质等相互作用，引起调控干细胞表面信号传递分子或关键转录因子的[86]表达，决定干细胞分化方向。2.2BMSCs胰岛样分化在临床上的应用BMSCs可以定向分化为胰岛素分泌细胞及成熟的胰岛β细胞，其在糖尿病治疗领域具有巨大的应用潜能，将BMSCs移植到体内发现其可改善血糖状况及机体免疫状态，同时可治疗糖尿病心血管并发症及糖尿病肾病变及神经病变等。目前，国内外研究结果均证明[70]BMSCs在临床应用方面具有良好的应用前景。Oh等利用基因技术，将转染PDX-1的人[87]BMSCs移植到糖尿病大鼠肾背囊内，结果在移植第12d后，血糖下降；Dong等将用5-溴-2’脱氧尿嘧啶（5-Bromo-2’-deoxyuridine,Brdu）和4’,6二脒基-2-苯吲哚盐酸（4’,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride,DAPI）标记BMSCs，移植到的糖尿病模型大鼠（链脲佐菌素Streptozotocin,STZｓ诱导）体内，观察到实验组的血糖和体重得到控制，[88]内源性胰岛出现再生;刘亚娟等证实将诱导后的BMSCs移植到坏死的组织，经病理组织[89]切片观察，可以修复损伤的胰腺组织；Boumaza等通过静脉移植将大鼠骨髓MSCs移植到[90]STZ诱导的同基因的糖尿病鼠体内，观察到胰岛素分泌增加，血糖恢复正常；Lee等将人骨髓MSCs经胸壁直接注入STZ诱导的NOD/SCID糖尿病模型小鼠的左心室内，观察到实验组胰岛细胞的损伤减轻，血糖得到控制。关于BMSCs的移植途径没有统一的标准，现[91]有的报道有：尾静脉、肝门静脉、肾被膜、胰腺内注射等。有报道显示肝静脉虽然血流丰富，可提供的足够生长因子，移植细胞分泌的胰岛素也易通过门静脉在肝脏进行修饰，但是在临床应用时需要注意肝内移植BMSCs易引起的肝脏炎性损害。本试验旨在体外通过添加生长因子，将兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为胰岛细胞，为临床治疗糖尿病奠定一定的理论基础。9 试验一不同分离方法及首次换液时间对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响引言骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜[92,93]能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究。[94,95]其具有易获得、易培养、低免疫源性等优点。目前，BMSCs在，在心肌梗死、组织再生、骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破。然而，骨髓中的MSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0．001％-0．01％，不能满足临床应用，因此，需要在体外分离纯化、培养扩增。研究表明，不同分离方法和首次换[96]液时间对骨髓间充质干细胞的增殖培养有很大的影响，本实验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs，为下一步研究和临床实验提供基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1实验动物30日龄的日本大耳白，雌雄不限，体重为750g左右，购自河南省实验动物中心。1.1.2主要试剂DMEM-F12干粉培养基（GIBCO）胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技有限公司）红细胞裂解液（北京赛驰生物科技有限公司）胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二钠、碳酸氢钠（Sigma）4%多聚甲醛（北京鼎国）0.5%TritonX-100（Sigma）BSA（Amresco）兔抗CD44、CD90、CD34抗体（北京博士德）生物素标记山羊抗兔IgG、山羊血清、HRP标记链霉亲和素生物素、DAB显色试剂盒、苏木素（北京华肽先锋）磷酸盐缓冲液（PBS）粉剂（武汉博士德）双抗（Solarbio）1.1.3主要仪器与器材10 CO2培养箱（HF151UV型HealForce）电子天平（METTLERTOLEDOAL104）HR型离心机（湘潭湘达离心机有限公司）恒温磁力搅拌棒（金坛市大地自动化仪器厂）超净工作台（AIRTECH）倒置显微镜（Leica）PH计（上海雷磁）KQ5200E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）微量移液器（eppendorf）滤器（PALL）225cm塑料培养瓶、盖玻片（corning）1.2试剂的配制1.2.1PBS缓冲液配制将成品袋装粉剂倒入500mL无菌烧杯中，先用少量新鲜三蒸水溶解，后定容到500mL，置于磁力搅拌器上进行搅拌，待充分溶解后，转移至2000mL容量瓶中，补足三蒸水定溶，摇匀，分装于500mL无菌玻璃瓶，高压灭菌30min，4℃冰箱贮存备用。1.2.20.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液称取胰蛋白酶粉剂0.25g、EDTA粉剂0.02g置于100mL灭过菌的烧杯内，加入少量灭菌的0.1mol/LPBS溶解，常温下磁力搅拌棒低速搅拌，补足PBS液至100mL，混匀后调节pH值为8.0，0.22µm孔径的一次性滤器过滤，无菌条件下分装在10mL的高压过的离心管中，注明试剂名称、PH值和配制时间，-20℃贮存备用。1.2.3双抗配制将购买的浓缩的链青霉素用灭菌的0.1mol/LPBS稀释，过滤分装，-20°保存。1.2.4FBS的冻融将FBS瓶装血清从从-20°C拿出后，4°C放置自然溶解，然后室温用0.22µm孔径的一次性滤器过滤，无菌条件下分装在10mL的高压过的离心管中分装。1.2.5DMEM/F-12完全培养基称取DMEM-F12干粉3.12g、0.24gNaHCO3分析纯，置于500mL烧杯内，加入178ml新鲜三蒸水，磁力搅拌棒搅拌均匀，待充分溶解后，按照10%的比例加入20mL的FBS，加入双抗2mL，用1mol/L的HCl溶液或NaOH溶液调节PH值至7.2-7.4范围内，充分搅拌，0.22µm孔径的一次性无菌滤过器过滤除菌、分装，注明培养基名称、配制时间、PH值，4℃贮存备用。1.2.6台盼蓝染色液11 4％台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，先加入少量0.1mol/L的PBS液研磨，然后加0.1mol/L的PBS液至100ml，磁力搅拌器搅拌均匀，用0.22µm的一次性滤器过滤，分装后于4℃贮存，现用现稀释为0.4%的工作液。1.3试验方法1.3.1BMSCs的提取用陆眠宁（846）将30日龄的日本大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，无菌条件下分离股骨、胫骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反复冲洗，剪断两侧干骺端，尽量多保留干骺端，DMEM-F12培养液反复冲洗骨髓腔于A、B两个10mL的离心管内，直至骨髓腔发白，1000r/min离心5min，弃上清。1.3.2全骨髓贴壁法A管用PBS重悬细胞，1000r/min离心5min洗涤2次，弃上清。吸取3mL含10%FBS2的DMEM-F12（1:100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm培养瓶，补足培养液至5mL，轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。以后每3d换液，待细胞生长融合至80%时传代培养。先弃去旧培养液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA，37℃条件下孵育3min，含血清的DMEM-F12终止消化。以1:2的比例传代培养，每3d换一次培养液。每天在倒置显微镜下观察细胞形态。1.3.3红细胞裂解法B管加入1mL红细胞裂解液重悬细胞，静置1~3min，待液体由红色变为白色后，加入5mLPBS液，1000r/min离心2次，5min/次，弃上清。吸取3mL含10%FBS的2DMEM-F12（1:100双抗）培养液重悬细胞，接种至3个25cm培养瓶，补足培养液至5mL，轻柔吹打均匀。置于37℃、5%CO2条件下培养。2d后首次换液，以后每3d换液，待细胞生长融合至80%时传代培养。先弃去旧培养液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA，37℃条件下孵育3min，含血清的DMEM-F12终止消化。以1:2的比例传代培养，每3d换一次培养液。每天倒置显微镜观察细胞形态。1.3.4兔BMSCs细胞活性检测原代培养48h时，各取一瓶细胞，弃去培养基，用PBS冲洗两遍，倒置显微镜下观察细胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%台盼蓝染色，血球计数板计数活细胞（未着色）和死细胞（着色细胞）。分别计算出两种不同分离方法的细胞活性。上述实验重复3次。1.3.5兔BMSCs生长曲线的绘制12 4选取生长良好的P1，P3和P8代细胞，以2.0×10个/孔，接种于24孔培养板中，每孔1mL，每3d换液一次，每天取3孔，消化后计数，取其平均值为当天的细胞数，连测8d，以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。1.3.6首次换液时间对兔BMSCs的影响将用红细胞裂解法分离得到的兔BMSCs按首次换液时间随机分为4组：12h换液组、24h换液组、48h换液组、72h换液组，以后每3d换液一次，记录传代前各组0~3代各代培养时间，各代细胞均保留3瓶。1.3.7细胞免疫组化鉴定兔BMSCs收集红细胞裂解法的P3代细胞，制备细胞爬片，常规SABC免疫组织化学方法检测表面抗原CD34、CD、CD45、CD90的表达。免疫细胞染色法鉴定兔BMSCs表面标记的步骤如下：将培养后的细胞爬片PBS浸洗3遍，每次3min；用4%多聚甲醛4°C固定20min，PBS浸洗3遍，每次3min；0.2%TritonX-100室温下透化10min，PBS浸洗3遍，每次3min；山羊血清稀释100倍，37℃下封闭20min，吸弃多余液体，不洗；分别滴加稀释400倍的一抗（CD34、CD44、CD90），4℃过夜；PBS浸洗3遍，每次5min；生物素标记山羊抗兔IgG稀释400倍，37℃作用20min，PBS浸洗3遍，每次5min；SABC液，37℃作用20min，PBS浸洗3遍，每次5min；新鲜配制的DAB显色液，镜下控制显色2-10min，蒸馏水中止；苏木素复染1～3min，自来水冲洗；自然晾干后中性树脂封片。空白对照：PBS代替一抗，相差显微镜观察并拍照。1.3.8统计学处理所得数据以均数±标准误表示，应用SPSS16.0统计学软件进行处理，采用单因素方差分析（one-wayANOVA），用MicrosoftExcel软件作图。2结果与分析2.1不同分离方法对兔BMSCs形态和生长的影响刚接种时，两种不同分离方法所得的原代细胞在倒置显微镜下观察细胞呈圆形，大小一致，折光性强，不容易区分。培养48h后，A、B两组细胞均可看见有圆形、短梭形、多角形细胞贴壁。B组贴壁细胞较A组细胞多，（见图1）。台盼蓝染色检测细胞活性全13 骨髓贴壁法（A组）为90%，红细胞裂解法（B组）为96%。随着培养的继续，大量细胞贴壁，并出现典型的BMSCs细胞集落，紧密排列。A组细胞生长较缓慢，所得细胞纯度较低；B组细胞生长较快，纯度较高。原代细胞达到传代的时间A组为10.2d，B组为7.2d,差异显著（P<0.05）。B组细胞P3代细胞呈旋涡状或放射状生长，细胞形态大小均一（见图2）。A:全骨髓贴壁法B:红细胞裂解法图1原代BMSCs培养48h后两种分离方法所得细胞贴壁情况（×100）Figure1Attachmentpropertyofbonemarrowmesenchymalstemcellsat48hoursaftertwomethodsculture(×100)A:WholebonemarrowcultureB:Redbloodcelllysis14 图2B组P3细胞（×100）Figure2P3bonemarrowmesenchymalstemcellsofBgroup(×100)2.2兔BMSCs生长曲线绘制通过细胞计数法绘制细胞生长曲线，对兔BMSCs的生长特性进行鉴定。结果显示，P1、P3、P8代细胞培养过程中，细胞生长具有相似的特点：1-2d细胞处于潜伏期；3-6d细胞处于对数生长期；6-8d左右生长逐渐减慢，开始进入平台期（见图3）。传代细胞生长相对稳定，随着传代次数的增加，细胞会出现衰老的特征，增殖速度减慢。P1、P3、P8代细胞生长曲线18161412P110P38P86细胞数量（10000）420012345678培养天数（d）图3P1，P3，P8代细胞生长曲线Fig3thegrowthcurveofP1、P3、P815 2.3兔BMSCs的鉴定用免疫细胞化学法对P3兔BMSCs进行鉴定，结果显示：CD44、CD90抗原阳性表达，CD34抗原阴性表达（见图4），符合BMSCs表面分子标记特征。A.CD44阳性表达；B.CD34阴性表达；C.CD90阳性表达图4免疫细胞化学染色鉴定兔BM-MSCs（×100）Fig.4rabbitBM-MSCsidentifiedbyimmunocytochemistry,(Invertedphasecontrastmicroscope,×100)A：CD44positive(×100)；B：CD34negative(×100)；C：CD90positive(×100)2.4首次换液时间对兔BMSCs培养周期的影响红细胞裂解法分离兔BMSCs，分别在12h、24h、48h、72h首次换液，结果（表1）显示：24h换液组P0代、P1代、P2代、P3代以及总时间的细胞培养时间与其他各组计较差异极显著，P<0.01。24h首次换液可缩短细胞培养周期。表1各组0~3代培养时间及培养总时间Table1EachgroupofcellculturetimeandtotalculturetimeofeachpassageP0P1P2P3总时间CbbBC12h换液10.00±0.004.67±0.004.00±0.004.00±0.0022.67±0.58AAAAA24h换液5.33±0.583.37±0.583.00±0.002.67±0.5814.00±1.OOBABBBB48h换液7.33±0.584.00±0.003.67±0.583.67±0.5818.67±1.52CBCBC72h换液9.33±0.584.67±0.585.00±0.004.00±0.0023.00±1.OO角标相同字母表示差异不显著（P＞0.05）；不同大写字母表示差异极显著（P﹤0.01）。Thesameletterindicatednosignificantdifferenceinthesamecolumn（P＞0.05）；Differentcapitallettersmeansignificantdifference（P﹤0.01）3讨论骨髓中BMSCs的含量非常低，一般为0.001%~0.01%，且其数量和生长能力与年龄呈显著的负相关，想要在临床实践中利用BMSCs，就必须实现其在体外的分离培养和扩增。16 目前，全骨髓贴壁法、红细胞裂解法、密度密度梯度法、免疫磁珠分选法和流式细胞术分选法是分离BMSCs常用方法，后两种方法筛选BMSCs的分选效率和纯度均较高，但是对实验条件和设备要求较高，费用昂贵，并且BMSCs表面缺乏特异性标志，在具体操作过[97]程中可造成细胞的损伤和死亡，所以较少使用。密度梯度法由于分离液往往对BMSCs[98]有一定的损伤，且离心会丢失大量的细胞，对细胞活性有影响，因此应用受到很大限制。本实验通过比较全骨髓贴壁法和红细胞裂解法，发现两种分离方法均可得到较均一的长梭形细胞，聚集成旋涡状均匀生长。但是红细胞裂解法分离得到的BMSCs在48h时贴壁细胞显著多于全骨髓贴壁法得到的BMSCs，并且细胞活性较高，细胞密度达到80%融合首次传代时间也较短。这可能是因为全骨髓贴壁分离法保留了造血干细胞和其它杂细胞，在体外培养过程中混杂的细胞会对BMSCs的生长及贴壁产生影响，所得BMSCs纯度和细胞活性均较低；而红细胞裂解液能够利用红细胞的渗透脆性特异性的破坏无核红细胞膜而去除红细胞和血小板，从而去除骨髓中含量最高的细胞成分，减小杂细胞对其贴壁的影响，为BMSCs贴壁及生长保留了空间和营养成分，有利于BMSCs的早期贴壁，所得细胞纯度高，[99]且细胞活力不受影响。张卫东等研究发现，红细胞裂解液处理后，早期BM-MSCs贴壁数量明显较未经红细胞裂解液处理所获得的数量多。细胞杂质经红细胞裂解液处理后，为[100][101]BM-MSCs贴壁保留了空间，有利于BM-MSCs的早期贴壁，Shah和Zhan等均利用红细胞裂解液从骨髓中分离出造血干细胞。因此，利用红细胞裂解法，能够缩短细胞培养周期，获得大量的高纯度、高活性的目的细胞，是一种有效的分离纯化BMSCs的方法。首次换液时间与BMSCs的生殖增长关系密切。原代首次换液时间过早，骨髓冲洗液中滋养骨髓间充质干细胞生长的的多种有益成分丢失丧失过早，导致贴壁细胞数量少，细胞生长缓慢，延长细胞培养周期；原代首次换液时间过晚，杂质贴壁紧密，细胞代谢产物等有害成分增多，造血干细胞分泌的生长因子使骨髓间充质干细胞出现分化等，从而导致细胞增殖周期延长。本试验分别在原代培养12h、24h、48h、72h首次换液，结果发现24h换液组，各代达到传代时间及细胞培养总周期与其他各组比较，差异有显著性意义，能显著缩短细胞培养时间，因此24h首次换液为最佳首次换液时间。BMSC由于没有发现特异性的表面标记物，因此其鉴定尚无统一标准。但BMSC表达内皮细胞、间质细胞、表皮细胞和肌肉细胞的表面标志，它包括（1）粘附分子CD44、CD105、CD166、CD54、CD102等；（2）整合素家族成员CD29、CD104、CD49a等；（3）其他CD90等。不表达造血干细胞表面标志，如CD34、CD45、CD11b、CD11a等。本试验利用细胞免疫化学法鉴定BMSCs，结果显示，分离培养的细胞阳性表达CD90和CD44，阴性表达CD34，符合骨髓间充质干细胞的表面标志物特征，证实我们体外分离培养的细胞为纯化的骨髓间充质干细胞。17 4、小结用红细胞裂解液法分离得到的兔BMSCs生物学性状稳定，生长增殖旺盛，体外培养传至P3代即可获得高纯度的BMSCs，因此选用第3代细胞作为进一步的研究对象最合适；在24h首次换液可显著缩短细胞的培养周期；免疫细胞化学染色法显示得出所分离培养的细胞CD44、CD90抗原阳性表达，CD34抗原阴性表达，符合BMSCs表面分子标记特征，证明分离得到的细胞为兔BMSCs。18 试验二兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛细胞的动态变化的研究引言无论在发达国家还是在发展中国家，糖尿病已成为仅次于癌症对人类健康危害最大的慢性代谢性疾病，给社会医疗保健带来了沉重的经济负担。1型糖尿病是自身免疫性疾病，由于诱发因素等导致抗胰岛素自身抗体产生，从而导致β细胞数量减少，功能减退，胰岛[102]素分泌降低；2型糖尿病与遗传因素和环境因素有关。目前，胰腺移植和胰岛移植是治疗糖尿病的有效手段，但是由于供体缺乏、免疫排斥、移植存活的胰岛细胞数量不足、胰岛功能障碍等限制了该项技术在临床的应用，国内外学着试图找到新的胰岛来源用于移植。研究表明，骨髓间充质干细胞在体外可定向诱导分化为胰岛素分泌细胞及胰岛细胞，为细胞移植治疗糖尿病带来新的希望。骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的一类具有强大的自我修复能力和多向分化潜能的间质祖细胞，若将自体的骨髓间充质体外诱导分化为胰岛素分泌细胞，既可解决胰岛移植供体不足的问题，又可避免异体移植带来的免疫排斥问题。BMSCs除了可向中胚层组织细胞分化外，也可跨胚层向内胚层和外胚层组织细胞分化，即具有跨胚层分化的特性。[103][104]Dong-Qi等将小鼠骨髓贴壁细胞在体外定向诱导分化为胰岛素分泌细胞；Chen等将骨髓间充质干细胞体外诱导为胰岛样细胞，诱导后的细胞能分泌胰岛素，将细胞注入糖尿病模型体内可降低血糖水平。本实验采用生长因子分阶段诱导法在体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞向胰岛β细胞分化，观察诱导过程中细胞形态及特异性基因表达的动态变化，探讨稳定高效的诱导体系，为未来的研究和临床应用奠定实验基础。1材料1.1试验材料1.1.1试验对象生长良好的P3代兔骨髓间充质干细胞1.1.2主要试剂DMEM/F12（GIBCO）H-DMEM，RPMI1640（Hyclone）胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技有限公司）19 双硫腙（Sigma）尼克酰胺（SBH-BIO公司）磷酸盐缓冲液（PBS）（武汉博士德生物公司）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），表皮生长因子（EGF），活化素A（ActivinA），肝细胞生长因子（HGF）（ProSpec）β-巯基乙醇（Amresco）B27(Invitrogen)正常山羊封闭血清（北京鼎国）HRP标记链霉亲和素（北京华肽先锋）DAB显色试剂盒（北京华肽先锋）生物素标记山羊抗兔IgG（北京华肽先锋）改良型苏木素（北京华肽先锋）4%多聚甲醛（北京鼎国）Elisa试剂盒（RD）RNAprepPureCell/BacteriaKit，TianscriptRTkitcDNA第一链合成试剂盒(天根生化公司)琼脂糖，DNAmarker2000（TaKaRa大连宝生生物制品有限公司）TAE电泳液，溴化乙锭（EB）（生工生物工程（上海）股份有限公司）1.1.3主要仪器与器械同试验一。1.2主要试剂配制1.2.1生长因子（bFGF，EGF，activin-A，HGF）配制为1µg/mL用未加血清的培养液DMEM-F12配制浓度为1µg/mL的生长因子（bFGF，EGF，activin-A，HGF）（100×），分装于1.5mL的PE管内，封口膜密封，-20℃保存备用。1.2.2配制1mol/LHEPES电子天平称取2.38gHEPES加入10mL的三蒸水，搅拌均匀，调节PH值为7.2-7.4，用0.22µm的一次性滤器过滤除菌，分装于1.5mL的PE管内，封口膜密封于-20℃保存备用。1.2.3不同浓度（0.23mol/L，0.175mol/L，0.111mol/L）葡萄糖的配制1.2.3.1配制0.23mol/L葡萄糖：取9.9mL的无血清DMEM-F12培养基加入0.414g葡萄糖、0.1mL的双抗，0.22µm滤膜过滤，分装1.5mL的PE管，-20℃备用。1.2.3.2配制0.175mol/L葡萄糖：取9.9mL的无血清DMEM-F12培养基加入0.315g葡萄20 糖、0.1mL的双抗，0.22µm滤膜过滤，分装1.5mL的PE管，-20℃备用。1.2.3.3配制0.111mol/L葡萄糖：取9.9mL的无血清DMEM-F12培养基加入0.1998g葡萄糖、0.1mL的双抗，0.22µm滤膜过滤，分装1.5mL的PE管，-20℃备用。1.2.4第一阶段的诱导剂取17.4ml的无血清高糖H-DMEM加入0.2mL的DMSO、0.2mL的FBS、0.2mL的1µg/mLbFGF、2mL的0.23mol/L葡萄糖，搅拌混匀，0.22µm滤膜过滤除菌，制成含有10ng/mL的bFGF，1%DMSO，1%FBS，23mmol/L葡萄糖的H-DMEM，-4℃备用。1.2.5第二阶段的诱导剂取41mL的无血清DMEM-F12，加入5mL的0.175mol/L葡萄糖、1mL的0.5mol/L尼克酰胺、1mL的1µg/mlEGF、1mL的1µg/mLbFGF、1mL的B27，0.22µm滤膜过滤，配制为含有10mmol/L尼克酰胺，20ng/mLEGF，20ng/mLbFGF，2%B27，17.5mmol/L葡萄糖的无血清DMEM-F12，-4℃备用。1.2.6第三阶段的诱导剂取42mL的RPMI1640液体培养基，加入5mL的0.111mol/L葡萄糖、1mL的0.5mol/L尼克酰胺、0.5mL的1µg/mLHGF，0.5mL的1mol/LHEPES，1mL的1µg/mLactivin-A，0.22µm滤膜过滤，配制成含有10mmol/L尼克酰胺，10mmol/LHEPES，20ng/mL的activin-A，10ng/mL的HGF，11.1mmol/L葡萄糖的诱导剂，-4℃备用。1.2.7双硫腙染色剂吸取5mL二甲基亚砜于10mL离心管中，称取50mg双硫腙粉末溶于其中，用移液枪轻轻吹打至溶解完全，0.22µm孔径滤器过滤后分装于0.5mL的锥形管中，密封-20℃冷冻贮存，用前解冻。1.2.80.2％TritonX-100取28.2mLTritonX-100及72.8mLPBS，混合后置于37℃~40℃水浴锅中2~3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至0.2％即可。1.2.9DAB显色液将DAB-试剂A和DAB-试剂B按1：19的体积比混匀后即为DAB显色液。DAB显色液必须先用现配，配制好后2~8℃避光1h内有效。2试验方法2.1体外定向诱导分化待P3细胞生长融合至80%时，用胰蛋白酶消化离心后，用DMEM/F-12完全培养液重悬细胞，分别置于A、B两个离心管管中，再次离心备用。21 试验组：用含10%FBS的DMEM/F-12培养基重悬A管细胞，制成单细胞悬液，细6胞计数调整1×10个/ml接种至预先铺好多赖氨酸处理的盖玻片的六孔板中，37℃、5%CO2条件下培养，待细胞生长铺满板底，三阶段定向诱导分化。第一阶段用含有10ng/mLbFGF、1%DMSO、1%FBS、23mmol/LGlucose的H-DMEM培养液对BMSCs诱导3d，第二阶段用含有10ng/mLbFGF、10ng/mLEGF、2％B27、17.5mmol/LGlucose、10mmol/L尼克酰胺的无血清DMEM/F-12培养液对BMSCs诱导8d，第三阶段用含有10mmol/LHEPES、10mmol/L尼克酰胺，2nmol/L的activin-A，11.1mmol/LGlucose的RPMI1640培养液对兔BMSCs诱导d，倒置显微镜下观察细胞形态学变化。对照组：用含10%FBS的DMEM/F-12培养基重悬B管细胞，制成单细胞悬液，细6胞计数调整1×10个/ml接种至预先铺好多赖氨酸处理的盖玻片的六孔板中，37℃、5%CO2条件下培养，每2d换液一次，直至试验组诱导结束。2.2双硫腙染色取试验组和对照组第3d、7d、10d、19d细胞，向每1ml培养体系中加入10ul双硫腙染色液，37℃孵育15min后弃去培养基，PBS液浸洗2次，3min/次，倒置显微镜下观察细胞着色情况。2.3RT-PCR检测胰岛细胞特异性基因的表达2.3.1细胞总RNA的提取（1）吸弃细胞培养液，将细胞用PBS洗2次；（2）每孔加1mlTrizol，用移液抢反复吹打使细胞完全裂解，室温静置5min。吸取孔内液体转移至1.5ml离心管。（3）加0.2ml氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15sec，待溶液充分乳化后，再室温静静置10min；（4）11000g4℃离心5min；（5）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；（6）向上清中加入500ul的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10min；（7）11000g4℃离心10min，收集沉淀；（8）小心弃去上清液，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7500g4℃离心5min后小心弃去乙醇；（9）室温干燥沉淀2～5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。（10）取出少量用于紫外分光光度计测定样品RNA的质量，测OD260和OD280，计算22 OD260／OD280，比值在1．8～2．0之间为佳。2.3.2反转录合成cDNA（1）根据TianscriptRTkitcDNA第一链合成试剂盒要求，在冰上配制RT反应液：表1反转录反应体系Table1systemofreversetranscription体系组分/componentofRT-PCR体系用量/volume（µL）模板RNA/RNAtemplate5Oligo-dt/Random(10mM)2dNTP混合液（2.5mM）25×First-StrandBuffer4RNasin0.5TIANScriptM-MLV1RNase-FreeddH2O.5总体积/total20（2）反转录条件：95℃5min42℃45min4℃∞（3）按上述条件进行反应，完成后将cDNA样品保存于-20℃。2.3.3PCR反应（1）反应体系表2RT-PCR反应体系Table2TheconditionofRT-PCRreaction成份使用量ReactioncomponentsVolumeMax6.75μLForwardPrimer(10μM)0.5μLReversePrimer(10μM)0.5μLcDNA模板0.5μLddH2O4.25μLTotal12.5μLRT-PCR反应条件：Stage1:预变性95℃5min;Stage2:95℃30sec,58℃30sec,72℃30sec;共35个循环；Stage3:72℃延伸10min。23 （2）引物合成参照GenBank中已公布的Pdx-1、Insulin1、Insulin2基因mRNA序列，用PrimerPremier5.0软件设计各基因序列引物和看家基因β-actin的引物。由上海生工生物工程股份有限公司合成，相关序列信息见表3。表3引物序列Table3Listofprimersusedinexperiment基因引物序列(5'-3')片段大小/bpGenePrimersequenceFragmentGAPDHforward:GGTCGGAGTGAACGGATTTG455reverse:AGCAGTTGGTGGTGCAGGATPDX-1forward:CCCATGGATGAAGTCTACC262reverse:GTCCTCCTCCTTTTTCCACInsulinforward:AAGTCCCGCCGCGAGGTG148reverse:GCAGATGCTGGTGCAACACGTNKX6.1forward:CCGCTTCAGCAGCCTGAGC202reverse:GAGTAGTTCCCAGGTAAAACGAC2.3.4琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在紫外投射仪下观察结果并用凝胶成像系统拍照。2.4免疫组织化学染色将第三阶段诱导末的细胞爬片取出后用PBS浸洗3次；4％的多聚甲醛4℃固定30min，PBS浸洗3次；0.2％的TritonX-100，室温下10min，PBS浸洗3次，5％的BSA封闭液37℃孵育封闭20min，结束后吸去封闭液，不洗；实验组加入兔抗胰岛素抗体（第一抗体，1：100稀释），4℃过夜，对照组加PBS，不加一抗，PBS浸洗3次，每次3min；实验组加入生物素标记的山羊抗兔IgG（第二抗体，1：100稀释），37℃孵育45min；PBS浸洗3次，每次3min；每张细胞爬片滴加合适稀释浓度的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，37℃孵育45min；PBS浸洗3次，每次3min；每张细胞爬片滴加100µl新鲜配制的DAB显色液，倒置显微镜下观察，达到适当显色强度时以流水漂洗终止显色反应，显色反应通常2~10min左右；自来水冲洗，苏木素染色液复染；蒸馏水冲洗，晾干，长满细胞的一面朝下，用中性树胶封在载玻片上。2.5ELISA检测24 分别收集试验组组和对照组第3、7、10、15、19d细胞的上清液，用酶联免疫吸附法检测上清液中胰岛素的含量。2.6数据处理试验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS16.0软件的One-WayANOVA的方法进行方差分析检验。3结果与分析3.1诱导分化过程中细胞的形态学变化试验组细胞诱导分化3d后，部分细胞变圆，细胞排列相对紊乱，折光性强，细胞界限清晰（图1A）；细胞诱导7d后，细胞之间聚集并开始形成团簇状，折光性良好，细胞边缘界限相对明显。继续诱导至第二阶段末，细胞团簇数量增加，直径增大，细胞边缘突起，界限较为明显（图1B）。诱导至第三阶段末，细胞团状物与周围开始分离，细胞融合，可以明显观察到细胞形态类似胰岛细胞（图1C）。对照组组细胞呈长梭形，细胞聚集呈旋涡状生长，细胞界限模糊，始终未出现细胞团（图1D）。ABD图1诱导分化过程中试验组和对照组细胞形态变化A:诱导3d细胞（100×），部分细胞变圆，细胞界限清晰；B：第二阶段诱导末（11d）细胞（40×），细胞团簇数量增加，直径增大；C：第三阶段诱导末（19d）细胞（200×），细胞团状物与周围开始分离，细胞融合，细胞形态类似胰岛细胞；D对照组细胞（100×），细胞呈长梭形，细胞始终未出现细胞团Fig.1Themorphologicalchangesofcellsoftheexperimentalgroupandthecontrolgroupintheprocessofdifferentiation.A：Thecells(100×)inthethirddayofinduction,partofcellsbecameroundandthecellboundarywasclear25 B:Thecells(40×)attheendofthesecondinductionphase(11d),thenumberofthecellclusterswereincteased,thediameterofcellclusterswerealsoincreased;C：Thecells(200×)attheendofthethirdinductionphase(19d),thecellclustersbegintoseparatefromthesurrounding;D：Thecells(100×)inthecontrolgroup,thecellswerelongshuttleinshapeandthereneverappearedcellcluster.3.2DTZ染色鉴定结果双硫腙染色后，试验组诱导分化3d时细胞未着色，7d、第二阶段诱导末、第三阶段诱导末细胞团呈现棕红色（图2A），提示细胞胞浆内产生富含锌离子的胰岛素。对照组的细胞不显色(图2B)。AB图2：双硫腙染色鉴定终末分化细胞A:第三阶段诱导末，DZT染色呈棕红色B:对照组细胞未着色Fig.2differentiatedcellswereidentifiedbydyeingwithdithizonedifferentiatedcellclusterswerestainedscarlet（FigAandB，originalmagnification×20;C，originalmagnification×100）3.3RT-PCR检测胰岛细胞特异性基因表达RT-PCR检测不同阶段分化细胞内特异性基因的表达情况。试验组第一阶段诱导（3d）末未见任何基因的表达，诱导第7d仅检测到Pdx-1基因的表达，Insulin-1和Insulin-2基因均未标的，说明此时已分化出胰岛前体细胞（图3A）。诱导第二阶段诱导末（10d）检测到PDX-1、Insulin表达（图3B）。诱导第三阶段诱导末（19d）检测到PDX-1、Insulin、Nkx6.1均基因表达，说明此时已分化出具有功能性的胰岛β细胞（图3C）。26 M1234M11234bp20001000750500250100AbpM123480070060020005004001000750300500250200100B100C图3RT-PCR特异性基因检测结果A:体外诱导7d,Pdx-1基因表达;B.体外诱导第二阶段末（11d）,Pdx-1和Insulin基因表达;C.体外诱导第三阶段末（19d）,Pdx-1、Insulin和NKX6.1基因表达;M.DNA相对分子质量标准DL2000;M1.DNA相对分子质量标准DL1500;1~4.GAPDH、Pdx-1、Insulin、Nkx6.1Fig.3TheresultofRT-PCRwithspecificgenesA.Inductionof3d,PDX-1geneexpression；B.Pdx-1andInsulingeneexpressionattheendofthesecondphaseinduced；C.PDX-1、InsulinandNkx6.1geneexpressionatstage3;M.DL2000Marker;M1.DL1500Marker3.4免疫细胞化学检测结果试验组细胞胞浆内出现大量棕黄色颗粒（图4A），免疫细胞化学反应呈现阳性结果，证明细胞内合成了胰岛素；对照组细胞则未出现棕黄色颗粒(图4B)，显示免疫细胞化学反应呈现阴性结果，说明胞浆内没有胰岛素存在。27 AB图4免疫细胞化学染色鉴定胰岛细胞（×100）A:诱导组B:对照组Fig.4Isletcellsidentifiedbyimmunocytochemistry(×100)A：InductiongrouppositiveB：Controlgroupnegative3.5ELISA检测结果试验组诱导分化第3、7、10、15、19d，ELISA检测培养上清液中胰岛素含量分别为21.11±0.12、29.2±0.50、32.23±0.24、35.21±0.28、35.01±0.17;；对照组胰岛素分泌量分别为20.10±0.20、21.11±0.22、22.04±0.11、23.01±0.06、23.36±0.21，第3d试验组上清液中胰岛素含量与对照组相比，差异不显著(P>0.05)，这是因为诱导第3d尚未出现细胞团样变化，未分泌胰岛素；第7、10、15、19d试验组上清液中胰岛素含量与对照组相比，差异极显著（P<0.05）。表1不同诱导时间细胞培养基中胰岛素含量Table1Insulincontentsincellculturesatdifferentinductiontime实验分组不同诱导时间培养基中胰岛素含量（Mu/L）3d7d10d15d19dAAAA对照组20.10±0.2021.11±0.2222.04±0.1123.01±0.0623.36±0.21BBBB试验组21.11±0.1229.2±0.5032.23±0.2435.21±0.2835.01±0.17注：同一列后标注A、B等不同字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05）。Note:A,B,etal,differentlettermeansverysignificantdifferencebetweenthetreatments(P<0.01),samelettermeansquitenotsignificantdifferencebetweentreatments(P＞0.01).28 4讨论近年来，细胞移植已成为用外科手术治疗糖尿病的研究热点，胰岛β细胞分泌大量胰[105，106]岛素的这一功能是独一无二的。骨髓间充质干细胞是存在于结缔组织中未分化的细胞，具有跨越胚层界限，分化为內胚层和外胚层细胞来源的细胞，由于其分化能力高、增殖快及低免疫原性，使其有望成为恢复受损胰岛β细胞，重建内源性胰岛素分泌系统的理想的种子[107，108，109]细胞。调控胰腺发育的因素主要包括细胞内调控因素和细胞外调控两大因素，大量研究表明，生长因子与胰岛细胞的发育和分化关系密切，其可作为诱导添加剂在体外诱导干细胞向胰岛素分泌细胞分化。目前，国内外很多学者通过在体外添加不同生长因子诱导干细胞定向特定功能的细胞分化已取得成功。本试验采用分阶段诱导法在体外使兔骨髓间充质干细胞向胰岛β细胞定向分化，成功获得胰岛样细胞团。高浓度的葡萄糖是骨髓间充质干细胞向胰岛[110]样分泌细胞定向分化过程中不可或缺的生理调节剂，不仅能够增加胰岛素的合成，同时[111][112]还可以刺激干细胞向胰岛β细胞分化。余卫等在研究用碱性成纤维细胞生长因子联合尼克酰胺在体外将小鼠胚胎干细胞诱导为胰岛样细胞时发现，应用高糖培养基在较短时间[113]内即可增强胰岛β细胞基因的表达，即应高糖环境对细胞的体外诱导非常重要。Caor等研究发现用低糖培养，即使添加生长因子，也不能使细胞分化为胰岛样细胞，而用高糖培养基添加生长因子即可使细胞分化为胰岛样细胞，进一步证实高糖是细胞定向诱导分化不可或[114]缺的刺激因子。然而，过高浓度的葡萄糖则可抑制细胞分化，Roche等发现25-30mmol/L可抑制β细胞分化。尼克酰胺是一种主要的内分泌细胞分化诱导剂，可以加快胰岛样细胞团[115,116]的形成，可以促进胎胰细胞分化并增加胰岛细胞数量，促进分化细胞的成熟。活化素[117]（ActivinA）是由性腺分泌的激素，高浓度的ActivinA可刺激干细胞向內胚层转化，其[118]可在成体干细胞中表达，可诱导成体干细胞向胰岛分泌细胞分化。双硫腙染色是鉴定胰岛细胞的一种有效手段，是一种锌离子鏊合剂，相对于其他细胞，[119]胰岛细胞中锌的含量很高，其经双硫腙染色后呈深棕红色。β细胞中的胰岛素结晶是由锌离子包裹的，我们利用双硫腙染色可以鉴定出从骨髓间充质干细胞分化出来的胰岛细胞[120][121]。尽管从干细胞分化而来的胰岛细胞可能从培养基中吸收胰岛素，但未诱导的对照组细胞经双硫腙染色后呈阴性，而诱导组细胞经染色后呈棕红色，可以证明胰岛素产生于分化细胞。用ELISA检测诱导第3、7、10、15、19d上清液中胰岛素含量，诱导组与对照组相比，7、10、15、19d上清中胰岛素含量差异显著，进一步说明诱导过程中胰岛素产生于分化细胞。胰腺发育过程中转录因子起到重要的作用，一些转录因子参与了胰腺的形态的发生和内泌细胞的分化。Pdx-1基因是胰腺发育过程中起重要作用，其在胰腺发育的整个过程中[122,123]均有表达，但在胰腺早期和成熟的β细胞中的表达尤为明显。Nkx6.1是特异表达于29 成熟β细胞的重要转录因子，在β细胞细胞分化过程中发挥重要的作用，确保定向分化的[124]内分泌细胞形成具有内分泌作用：分泌胰岛素。Sander等研究表明，在缺失Nkx6.1蛋白的小鼠体内，与正常细胞相比，其成熟的β细胞的数量明显减少，表明Nkx6.1参与胰腺[125]后期发育、β细胞的成熟。Schisler等发现，Nkx6.1是一种能够刺激β细胞增殖和胰岛细胞数增加的细胞因子。本试验在诱导的第7d时，检测到PDX-1基因的表达，说明此时已分化出胰岛素分泌细胞的前体细胞，提示兔BM-MSCs向胰岛细胞分化过程中也经历胰岛祖细胞；诱导第19d检测到Pdx-1、Insulin、Nkx6.1基因的表达，说明此时已分化出有功能的胰岛细胞。免疫细胞化学法检测到诱导后细胞中胞浆内出现大量棕黄色颗粒，呈阳性反应，进一步从蛋白水平上说明诱导过程中产生胰岛素。5小结本试验证实了生长因子分阶段诱导法，可成功的将兔骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛细胞，诱导周期相对较短，形成的细胞团相对较多，胰岛素分泌量相对较高,本研究证实兔骨髓间充质干细胞在体外具有分化为胰岛细胞的潜能，为临床治疗糖尿病提供新的途径与思路。30 结论1、采用红细胞裂解液法分离兔BMSCs，24h首次换液能够提高骨髓间充质干细胞的活性，缩短细胞培养周期，所得细胞生物学特性稳定，3-6d细胞处于对数生长期，增殖活性好，具有多向分化能力。2、兔BMSCs细胞在体外通过添加bFGF、EGF、HGF、B27、尼克酰胺等生长因子可诱导分化为胰岛β细胞，31 参考文献[1]NarangAS,MahatoRI.Biologicalandbiomaterialapproachesforimprovedislettransplantation[J].Pharmacologicalreviews,2006,58(2):194-243.[2]SCHAMPERISTSANIRASandPMJONES.Generatingpancreaticb-cellsfromembryonicstemcellsbymanipulatingsignalingpathwayss[J].JournalofEndocrinology(2010)206,13–26.[3]CalneR.Celltransplantationfordiabetes[J].PhilosophicalTransactionsoftheRoyalSocietyB:BiologicalSciences,2005,360(1461):1769-1774.[4]SoriaB,RocheE,BernáG,etal.Insulin-secretingcellsderivedfromembryonicstemcellsnormalizeglycemiainstreptozotocin-induceddiabeticmice[J].Diabetes,2000,49(2):157-162.[5]ShaoS,GaoY,XieB,etal.Correctionofhyperglycemiaintype1diabeticmodelsbytransplantationofencapsulatedinsulin-producingcellsderivedfrommouseembryoprogenitor[J].JournalofEndocrinology,2011,208(3):245-255.[6]PeterJDarlington,Marie-NoelleBoivin,AmitBar-Or.Harnessingthetherapeuticpotentialofmesenchymalstemcellsinmultiplesclerosis[J].ExpertReviewofNeurotherapeutics.2011,11(9):1295-1303.[7]AssadyS,MaorG,AmitM,etal.Insulinproductionbyhumanembryonicstemcells[J].Diabetes,2001,50(8):1691-1697.[8]BaiL,MeredithG,TuchBE.Glucagon-likepeptide-1enhancesproductionofinsulinininsulin-producingcellsderivedfrommouseembryonicstemcells[J].Journalofendocrinology,2005,186(2):343-352.[9]HussainMA,TheiseND.Stem-celltherapyfordiabetesmellitus[J].TheLancet,2004,364(9429):203-205.[10]SeewoodharyJ,EvansPJ.Diabetesandstemcells:Endogenouseffectsandreparativemechanisms[J].TheBritishJournalofDiabetes&VascularDisease,2013,13(5-6):224-228.[11]M.Patel,S.YangAdvancesinReprogrammingSomaticCellstoInducedPluripotentStemCells[J].StemCellRevandRep(2010)6:367–380[12]SerupP,MadsenOD,Mandrup-PoulsenT.Isletandstemcelltransplantationfortreatingdiabetes[J].Bmj,2001,322(7277):29-32.32 [13]MoritohY,YamatoE,YasuiY,etal.Analysisofinsulin-producingcellsduringinvitrodifferentiationfromfeeder-freeembryonicstemcells[J].Diabetes,2003,52(5):1163-1168.[14]RaffM.Adultstemcellplasticity:factorartifact[J].Annualreviewofcellanddevelopmentalbiology,2003,19(1):1-22.[15]PerinEC,GengYJ,WillersonJT.Adultstemcelltherapyinperspective[J].Circulation,2003,107(7):935-938.[16]DharmasarojaP.Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsforthetreatmentofischemicstroke.JClinNeurosci.2009,16(1):12-20.[17]RichardsM,HuibergtseBA,CaplanAI,etal.Marrow2derivesprogenitorcellinjectionsenchancenewboneformationduringdistraction[J].JOrthopRes,1999,17(6):900-908.[18]吕婧玉，和小娥，张志平，许晓婷，冯建昆，王新庄等.红细胞裂解法及不同培养条件对兔骨髓间充质干细胞体外增殖的影响[J].江西农业学报，2012，11：132-135.[19]XieQP,HuangH,XuB,etal.Humanbonemarrowmesenchymalstemcellsdifferentiateintoinsulin-producingcellsuponmicroenvironmentalmanipulationinvitro[J].Differentiation,2009,77(5):483-491.[20]ZaretKS,GrompeM.Generationandregenerationofcellsoftheliverandpancreas[J].Science,2008,322(5907):1490-1494[21]GiulianaFerrari,GabriellaCusella,DeAngelis,etal.MuscleregenerationbyboneMarrowderivedmyogenicprogenitors[J].Science.1998,279(5356):1528-1530.[22]CharalamposPontikoglou,BrunoDelorme,PierreCharbord.Humanbonemarrownativemesenchymalstemcells[J].Regenerativemedicine.2008,3(5):731-741.[23]LinyiPeng,ZhuqingJia,XinhuaYin,etal.Comparativeanalysisofmesenchymalstemcellsfrombonemarrowcartilageandadiposetissue[J].StemCellsandDevelopment.2008,17(4):761–773.[24]贾秀娟，孙晓娟，徐丽丽.特定微环境条件下人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞[J].中国组织工程研究与临床康.2008，12(34)：6635-6638.[25]BrunoLorenzi,FedericaPessina,PaolaLorenzoni,etal.Treatmentofexperimentalinjuryofanalsphincterswithprimarysurgicalrepairandinjectionofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells[J].DiseasesoftheColon＆Rectum.2008,51(4):411–420.[26]LinyiPeng,ZhuqingJia,XinhuaYin,etal.Comparativeanalysisofmesenchymalstemcellsfrombonemarrowcartilageandadiposetissue[J].StemCellsandDevelopment.2008,17(4):761–773.[27]XiaoxiaoLong,MarieOlszewski,WeiHuang,etal.Neuralcelldifferentiationinvitrofromadulthumanbonemarrowmesenchymalstemcell[J].Stemcellsanddecelopment.2005,33 14(1):65-69.[28]CharalamposPontikoglou,BrunoDelorme,andPierreCharbord.Humanbonemarrownativemesenchymalstemcells[J].Regenerativemedicine.2008,3(5):731-741.[29]DharmasarojaP.Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsforthetreatmentofischemicstroke.JClinNeurosci.2009,16(1):12-20.[30]RichardsM,HuibergtseBA,CaplanAI,etal.Marrow2derivesprogenitorcellinjectionsenchancenewboneformationduringdistraction[J].JOrthopRes,1999,17(6):900-908.[31]GiulianaFerrari,GabriellaCusella,DeAngelis,etal.Muscleregenerationbybonemarrow-derivedmyogenicprogenitors[J].Science.1998,279(5356):1528-1530.[32]BlancKL,PittengerMF.Mesenchymalstemcells:Progresstowardpromise[J].Cytotherapy.2005,7(1):36-45.[33]KumarSS,BhuvanalakshmiGB,GowriM,etal.MorphologicalcomparisonofbonemarrowderivedmesenchymalstemcellfromalbinoratsandIndianchicken[J].EurJAnat,2013,17(1):17-22.[34]王运涛.骨髓间充质干细胞分离培养的研究进展[J].国外医学：生物工册.2002，25(4):184-188.[35]YINAH,Miraglia,EsmailDZ,etal.AC133,anovelmarkerforhumanhematopoieticstemandprogenitorcells[J].Blood,1997,90:5002-5012.[36]ProckopDJ.Marrowstromalcellsasstemcellsfornonhematopoietictissues[J].Science,1997,276:71-75.[37]LeeJW,GuptaN,SerikovV,etal.Potentialapplicationofmesenchymalstemcellsinacutelunginjury[J].2009.，9（10）：1259-1270[38]JarochaD,LukasiewiczE,MajkaM.Adventageofmesenchymalstemcells(MSC)expansiondirectlyfrompurifiedbonemarrowCD105+andCD271+cells[J].FoliaHistochemCytobiol.2008,46(3):307-314.[39]HeliciaPaz,ChristieA,Wong,WeiLi,eta1．QuiescentsubpopulationsofhumanCD34-positivehematopoieticstemcellsarepreferredtargetsforstablerecombinantadeno-associatedvirustype2transduction[J].HumanGeneTherapy.2007,18(7):614-626.[40]WulfGG,JacksonKA,GoodellMA.Somaticstemcellplasticity:currentevidenceandemergingconcepts[J].ExpHematol.2001,29(12):1361-1370.[41]FriedensteinAJ.GorskajaJF,KulaginaNN.Fibroblastprecursorsinnormalandirradiatemousehematopieticorgans[J].Experimentalhematology.1976,4(5):267-274.[42]FriedensteinAJ,ChailakhyanRK,GerasimovUv.Bonemarrowosteogenicstemcells:invitrocultivationandtransplantationindiffusionchambers[J].CellTissueKinet,34 1987,20(3):263-272.[43]翁玄，朱勇军，张健，等.不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生物活性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复.2010，14(10)：1775-1779.[44]PittengerMF,MackayAM,BectSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells[J]．Science1999；284(5411)：143-147.[45]AndreaLipoldta,BethAndbjer,LarsRoseb,Petterssonetal.Photochemicallyinducedfocalcerebralischemiainrat:timedependentandglobalincreaseinexpressionofbasicfibroblastgrowthfactormRNA[J].BrainRes,1993,625(1):45-5.[46]DennisJE,CharbordP.OriginanddifferentiationofHumanandmurincstorome[J].StemCells,2002,20(3):205-214.[47]蔡磊.大鼠CKIα的原核表达、纯化和携带大鼠CKIα基因慢病毒载体的构建及转染鼠BMSCs的实验研究[D].南方医科大学,2013[48]TeradaN,HamazakiT,OkaM,etal.Bonemarrowcellsadoptthephenotypeofothercellsbyspontaneouscellfusion[J].Nature,2002,416（6880）:542-545.[49]YingQL,NicholsJ,EvansEP,etal.Changingpotencybyspontaneousfusion[J].Nature,2002,416（6880）:545-548[50]MezeyE,ChandrossKJ,HartaG,etal.Turningbloodintobrain:cellsbearingneuronalantigensgeneratedinvivofrombonemarrow[J].Science,2000,290(5497):1779-1782[51]WangX，WillenbringH，AkkariY,eta1．CellfusionisthePrincipalsourceofbone—marrow-derivedhepatocytes[J]．Nature，2003；422：897—901．[52]JiangY,VaessenB,LenvikT,etal.Multipotentprogenitorcellscanbeisolatedfrompostnatalmurinebonemarrow,muscle,andbrain[J].ExpHematol,2002,30(8):896-904.[53]PittengerF.Whenbodycannotheathimself[J].Nature,2001,414:132.[54]TLHalvorsen,GMBeattie,ADLopez,etal.Acceleratedtelomereshorteningandsenescenceinhumanpancreaticisletcellsstimulatedtodivideinvitro[J].Endocrinol.2000,166:103-109.[55]KocON,LazarusHM.Mesenchymalstemcells:headingintotheclinic[J].BonemarrowTranplantion.2001,27(3):235-239.[56]Koc．O．N．，andLazarus，H．M．Mesenchymalstemcells：headingintotheclinicBonemarrowtransplantation(2001)27(3),235—239[57]YongRG,BuderDL,WeberW,etal.Useofmesenchymalstemcellsinacol1agenmtrixforAchillestendonrepair.JOrthopRes1998;16(4):406—13[58]KocherAA;SchusterMD;SzabolcsMJNeovascularizationofischemicmyocardiumby35 humanbone-marrow-derivedangioblastspreventscardiomyocyteapoptosis,reducesremodelingandimprovescardiacfunction.2001(04)[59]Pontikoglou，C．。Delorme，B．，andCharbord,EHumanbonemarrownativemesenchymalStemcellsRegenerativemedicine(2008)3(5),73l一74l[60]Bayes—GenisA，SalidoM，SoleRistolF，eta1．Hostcell-derivedcardiomyocytesinsex—mismatchcardiacallografts．CardiovascRes，2002；56：404-410．[61]LiY，ChoopM,ChenJ,etal.Intrastriataltransplantationofbonemarrownonhematopoieticcellsimprovesfunctionalrecoveryafterstrokeinadultmice．JCerebBloodFlow,2000;20(9)：1311[62]KopenGC，ProckopDJ，PhinneyDG．Marrowstromalcellsmigratethroughoutforebrainandcerebellum，andtheydifferentiateintoastrocytesafterinjectionintoneonatalmousebrains．ProcNatlAcadSciUSA,1999,96：10711-10716．）[63]MorigiM，ImbertiB，ZojaC，eta1．Mesenchymalstemcellsarerenotropic，helpingtorepairthekidneyandimprovefunctioninacuterenalfailure．JAmSocNephrol，2004,15：1794-1804．[64]王佳南，张晓刚，汤为学，等.大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件.[J]中国组织工程研究与临床康复.2009,13（14）：2741-2745.[65]SchuldinerM,YanukaO,Itskovitz．EIdorJ,eta1．Effectsofeightgrowthfactorsonthedifierentiationofcellsderivedfromhumanembryonicstemcells．ProcNatlAcadSciUSA2000;97(21)：11307一11312[66]YusukeMoritoh,EijiYamato,YumikoYasui,etal.Analysisofinsulin-producingcellsduringinvitrodifferentiationfromfeeder-freeembryonicstemcells[J].Diabetes.2003,52(5):1163-1168.[67]KOLFCM,CHOE,TUANRS.Biologyofadultmesenchymalstemcells:regulationofniche,self-renewalanddifferentiation[J].2007,9(1):204[68]RamiyaVK,MaraistM,ArforsKE,etal.Reversalofinsulindependentdiabetesusingisletsgeneratedinvitrofrompancreaticstemcells[J].NatMed,2000,6(3):278-282[69]李艳华，白慈贤，谢超，等．成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为胰岛样细胞团的研究[J]．自然科学进展,2003,13(6)：593-597．[70]OhSH，HatchHM，PetersenBE．Hepaticovalstemcellinliverregeneration[J]．SeminCellDevBiol,2002,13：405-409．[71]SunY,ChenL,HouXG,etal.Differentiationofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsfromdiabeticpatientsintoinsulin-producingcellsinvitro[J].ChinMedJ(Enhl),2007,120(9):771-77636 [72]KnepelW.Transcriptionalcontrolofpancreaticislethormonesgeneexpression[J].ExperimantalClinicalEndocrinology.1993,101(1):39-45.[73]NayaFJ,StellrechtCM,TsaiMJ.Tissue-specificregulationoftheinsulingenebyanovelbasichelix-loop-helixtranscriptionfactor[J].GenesDevelopment.1995,9(8):1009-1019.[74]HideakiK,TakeshiM,DanK,etal.PleiotropicrolesofPDX-1inthePancreas[J].TheReviewofDiabeticStudies,2007,49(4):209-225[75]LiY,ZhangR,QiaoH,etal.Genetationofinsulin-producingcellsfromPDX-1gene-modifiedhumanmesenchymalstemcells.JCellPhysiol,2007,211:36-44.[76]GuG,DubauskaiteJ,MeltonDA.Directevidenceforthepancreaticlineage:NDN3positivecellsareisletprogenitorsandaredistinctfromductprogenitors.Development,2002,129(10):2447-2457.[77]SerafimidisI,RakatziI,EpiskopouV,etal.NoveleffectorsofdirectedandNgn3-mediateddifferentiationodmouseembryonicstemcellsintoendocrinepancreasprogenitors.Stemcells.2008;26(1):3-16.[78]YangYP,ThorelF,BoyerDF,HerreraPL,WrightCV.Context-specificα-to-β-cellreprogrammingbyforcedPdx-1xepression.GenesDev,2011,25(16):1680-1685.[79]BlyszczukP,CzyzJ,KaniaG,etal.ExpressionofPdx-4inembryonicstemcellspromotesdifferentiationofnestin-positiveprogenltorandinsulin-producingcells.ProcNatlAcadSciUSA.2003;100(3):998-1003.[80]AndersonKR,WhiteP,KaestnerKH,SusselL.IdentificationofknownandnovelpancreasgenesexpresseddowntrwamofNkx2.2duringdevelopment.BMCDevBiol2009;9:65[81]SchafferAE,FreudeKK,NelsonSB,SanderM.Nkx6transcriptionfactorsandPtflafunctionasantagonisiticlineagedeterminantsinmultipotentpancreaticprogenitors.DevCell2010;18:1022-1029.[82]SchislerJC,JensenPB,TaylorDG,etal.TheNkx6.1homeodomaintranscriptionfactorsuppessesglucagonexpressionandregulatesglucose-stimulatedinsulinsecretioninisletbetacells.ProcNatlAcadSciUSA.2005;102(20):7297-7302.[83]ChoiKS,ShinJS,LeeJJ,etal.Invitrotrans-differentiationofratmesenchymalcellsintoinsulin–producingcellsbyratpancreaticextract.BiochemBhondeResCommun,2005,330:1299-1305.[84]沈浩亮，王志伟，朱铭岩，等.体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化[J].中华胰腺病杂志，2008，8（6）：397-400.[85]KanitkarM,BhondeR.Existenceofinletregeneratingfactorswithinthepancreas.RevDiabetStud,2004,1:185-192.37 [86]CatherineMKolf,ElizabethCho,RockySTuan.Biologyofadultmesenchymalstemcells:regulationofniche,self-renewalanddifferentiation[J].ArthritisResearchTherapy.2007,9(1):204.[87]DongQY,ChenL,GaoGQ,etal.Allogeneicdiabeticmesenchumalstemcellstransplantationinstreptozotocin-induceddiabeticrat[J].ClinInvestMed,2008,31:328-337.[88]刘雅娟,李秀东,陈强,等.BMSCs体外诱导分化为胰岛样细胞及其对坏死胰腺组织的修复.吉林大学学报（医学版）,2005,31(6):836-839.)[89]BoumazaI,SrinivasanS,WittWT,etal.Autologousbonemarrow-derivedratmesenchymalstemcellspromotePDX-1andinsulinexpressionintheislets,afterTcellcytokinepatternandpreserveregulatoryTcellsintheperipheryandinducesustainednormoglycemia[J].JAutoimmun,2009,32:33-42.[90]LeeRH,SeoMJ,RegerRL,etal.Multipotentstromalcellsfromhumanmarrowhometoandrenalglo-meruliindiabeticcNOD/scidmice[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103:17438-17443.[91]王方，周一鸣，张小岗，等．骨髓干细胞移植对急性肝功能损伤大鼠治疗的实验研究[J]．西北国防医学杂志,2010,3l(1):40-42.[92]KumarSS,BhuvanalakshmiGB,GowriM,etal.MorphologicalcomparisonofbonemarrowderivedmesenchymalstemcellfromalbinoratsandIndianchicken[J].EurJAnat,2013,17(1):17-22.[93]HagmannS,MoradiB,FrankS,etal.Differentculturemediaaffectgrowthcharacteristics,surfacemarkerdistributionandchondrogenicdifferentiationofhumanbonemarrow-derivedmesenchymalstromalcells[J].BMCmusculoskeletaldisorders,2013,14(1):223.[94]BobisS,JarochaD,MajkaM.Mesenchymalstemcells:characteristicsandclinicalapplications[J].FoliaHistochemicalCytobiology.2007,44:215–230.[95]FarbodRastegar,DeanaShenaq,JiayiHuang,etal.Mesenchymalstemcells:Molecularcharacteristicsandclinicalapplications[J].WorldJournalStemCells.2010,2(4):67–80.[96]黎婷，孙晋虎，赵亮，等.离心分离法和贴壁分离法对培养骨髓间充质干细胞生物学特性的影响[J].中国现代医学，2010，48（5）：29-31.[97]AndreaLipoldta,BethAndbjer,LarsRoseb,Petterssonetal.Photochemicallyinducedfocalcerebralischemiainrat:timedependentandglobalincreaseinexpressionofbasicfibroblastgrowthfactormRNA[J].BrainRes,1993,625(1):45-5.[98]PittengerMF,MackayAM,BectSC,etal.Multilineagepotentialofadulthumanmesenchymalstemcells[J]．Science1999；284(5411)：143-147.[99]张卫东，章方彪，史宏灿，等.红细胞裂解液法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞[J].38 中国组织工程研究.2013，17(49)：8468-8473.[100]RitaShah,andRahulM.Jindal.StabletransfectionofratpreporinsulinIIgeneintorathematopoieticstemcellsviarecombinantadeno-associatedvirus[J].LifeScience.1999,65(20):2041-2047.[101]ZhanYutao,WeiLai,ChenHongsong,eta1.Enrichmentofratbonemarrowstemcellbyflowcytometer[J].JournalofImmunology.2003,19(6):471-473.[102]AtkinsonMA,EisenbarthGSType1diabetes:newperspectivesondiseasepathogenesis!andtreatment[J].Lancet,2001,358(9277):221-229![103]DrongAW,LindgrenCM,McCarthyMI.Thegeneticandepigeneticbasisoftype2diabetesandobesity[J].ClinPharmacolTher,2012,92(6):707715.[104]TANGDQ,CAOLZ,BRANTR.BURKHARDT,etal.Invivoandinvitrocharacterizationofinsulin-producingcellsobtainedfrommurinebonemarrow[J].Diabetes,2004,53(7):1721-1732[105]ChenCZ,LiL,LodishHF,etal.MicroRNAsmodulatehematopoieticlineagedifferentiation[J].Science.2004,1303(5654):83-86.[106]K.Miller,A.Kim,G.Kilimnik,etal.,Isletformationduringtheneonataldevelopmentinmice,PLoSOne4(2009).e7739doi:10.1371/journal.pone.0007739.[107]K.Minami,S.Seino,Pancreaticacinar-to-betacelltransdifferentiationinvitro,Front,Biosci,13(2008)5824–5837.[108]SiYL,ZhaoYL,HaoHJ,etal.MSCSs:Biologicalcharacteristics,clinicalapplicationsandtheiroutstandingconcerns.AgeingResRev,2011,10:93-103[109]CorporationHP.AModifiedMethodofInsulinProducingCells'GenerationfromBoneMarrow-DerivedMesenchymalStemCells[J].JournalofDiabetesResearch,2014,1-7.DOI:10.1155/2014/628591[110]VijaL,FargeD,GautierJF,etal.Garcia-GomezI,ElviraG,ZapataAG,etal.Mesenchymalstemcells:biologicalpropertiesandclinicalapplications.ExpertOpinBiolTher,2010,10:1453-1468.Mesenchymalstemcells:Stemcelltherapyperspectivesfortype1diabetes.DiabetesMetab,2009,35:85-93.[111]BarbaraLeibiger,KarinWahlander,Per-OlofBerggren,etal.Glucose-stimulatedinsulinbiosynthesisdependsoninsulin-stimulatedinsulingenetranscription[J].JournalBiologicalChemistry.2000.275(39):30153–30156.[112]余卫，张洹，何冬梅．体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究[J].第二军医大学学报,2004,25(8):827---83039 [113]TaoLZ,TangDQ,HorbME,eta1.HighglucoseisnecessaryforcompletematurationofPdxl—VP16-expressinghepaticcellsintofunctionalinsulin-producingcells[J].Diabetes,2004,53(12):3168~3178[114]RocheE,MedaP,BossieS,eta1.Inductionbyglucoseofgenescodingforglycolyticenzymesinapancreaticbeta—cellline(INS-1)[J].JBoilChem，1997，272(5)：3091．3098[115]RamiyaVK,MaraistM,AlforsKE,eta1.Reversalofinsulin-dependentdiabetesusingisletsgeneratedinvitrofrompancreaticstemcells.NatMed,2000,6(3):278—282.[116]VacaP,BemaG,MartnF,etal.Nicotinamidereducesbothproliferationanddifferentiationofembryonicsteincellsintoinsulin-producingcells．TransplantProc,2003,35(5):2021-2023.[117]KumarM,JordanN,MeltonD,eta1.Signalsfromlateralplatemesodetminstructendodamtowardapancreaticfate．DecBiol,2003,259(1):109-122.[118]ZulewskiH,AbrabamEJ,GerlaehMJ,eta1.Multipotentialnestin-positivestemcellsisolatedfromadultpancreaticisletsdifferentiateexvivointopancreaticendocrine,exognnc,andhepaticphenotypes.Diabetes,2001,50(3):521-533.[119]A.B.Chausmer,Zinc,insulinanddiabetes,J.Am.Coll.Nutr.17(1998)109–115.[120]J.Rajagopal,W.J.Anderson,S.Kume,etal.,InsulinstainingofEScellprogenyfrominsulinuptake,Science,299(2003):363.[121]P.Vaca,F.Martín,J.M.Vegara-Meseguer,etal.,Inductionofdifferentiationofembryonicstemcellsintoinsulin-secretingcellsbyfetalsolublefactors,Stemcells24(2006)258–265.[122]McKinnon,CM,Docherty,K.Pancreaticduodenalhomeobox-1,PDX1,amajorregulatorofbetacellidentityandfunction.Diabetologia44(10):1203–1214;2001.[123]S.H.Chiou,S.J.Chen,Y.L.Chang,etal.,MafApromotesthereprogrammingofplacenta-derivedmultipotentstemcellsintopancreaticislets-likeandinsulincells[J].CellMol.Med.15(2011)612–624.[124]M.Sander,L.Sussel,J.Conners,etal.HomeoboxgeneNkx6.1liesdownstreamofNkx2.2inthemajorpathwayofbeta-cellformationinthepancreas[J].Development.2000,127:5533-5540.[125]JonathanC.Schisler,PatrickT.Fueger,DaniellaA.Babu,etal.Stimulationofhumanandratisletβ-cellproliferationwithretentionoffunctionbythehomeodomaintranscriptionfactorNkx6.1[J].MolecularCellBiology.2008,28(10):3465-76.40 英文缩写词表缩写词中文全名BM-MSCs（BoneMarrowMesenchymalStemCell）骨髓间充质干细胞MSCs间充质干细胞ES胚胎干细胞AS成体干细胞PBS无钙镁磷酸盐缓冲液FBS胎牛血清MTT噻唑蓝DMSO二甲基亚砜DTZ双硫腙HRP辣根过氧化物酶bFGF碱性成纤维细胞生长因子HGF肝细胞生长因子EGF表皮生长因子β-cellulinβ细胞调节素ActivinA活化素AIPCs胰岛样细胞团Insulin胰岛素PDX-1胰和十二指肠同源框基因-141 THESTUDYOFRABBITBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSCULTURE,CRYOPRESERVATIONANDDIFFERENTIATIONINTOPANCREATICβCELLSINVITROSupervisor:Prof.WangXinzhuangMaster(Ph.D)Candidate:ChenXiaopeiABSTACT【Objective】Theexperimentintendstoexploreanefficientinductionsystemofdirectionaldifferentiationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsintoisletbetacellsinvitro,thusitcanprovideatheoreticalbasisforthefurtherresearchandclinicalapplicationofstemcellsinthetreatmentofdiabetes.【Methods】BMSCswereobtainedbyredbloodcelllysisandwholebonemarrowculture.ThecellmorphologyofBMSCswasobservedunderinvertedmicroscope,thecellviabilitywasdetectedbytrypanbluestaining,thefirsttimeofpassagewasrecorded,theCD90、CD44、CD34antigenexpressionweredetectedbyimmunocytochemistrytechnique.Thefirsttimewaschangedrespectivelyat12h、24h、48h、72h,thenallgroupswereexchangeevery2d.Theperiodofeachpassageweremeasured;ThistestweuseP3generationcells,growthfactorsthree-stepstrategywasadoptedtoinduceBMSCstodifferentiatetowardisletcells.Thefirstphasecontains10ng/mLbFGF,1%DMSOand1%FBS,23tendencyLGlucoseH-DMEMcultureofBMSCsinducedby3d,thesecondphasecontaining10ng/mLbFGF,10ng/mLEGF,2%B27andtendencyfor17.5/LGlucose,10tendencyofnicotinamideserum-freeDMEM/LF-12cultureofBMSCsinduced8d,thethirdstagewithcontain10tendencyLHEPES,10tendencyforLniacinamide,2nmol/LofactivinA,thetendencyfor11.1/LGlucoseRPMI1640cultureofrabbitBMSCsinduced8d.ThecellmorphologyofBMSCswasobservedunderinvertedmicroscope;Thedifferentiatedcellsweretestedbydithizonestaining(DTZ).RT-PCRwerecarriedouttodectecttheexpressofinsletcellsrelatedgene(Pdx-1、Insulin、Nkx6.1),andtheexpressionofspecificproteinlikeInsulininderivedcellswasinvestigatedbyimmunocytochemistrytechnique;InsulinsecretionwasassayedbyELISA.42 【Result】TheresultshowedthatBMSCscouldbeisolatedbytwomethods.Theadherecellsshowedshuttleorgatheredintoavortex-likeuniformgrowth,andpositiveforCD90、CD44antigen,negativeforCD34.BMSCsisolatedbytheredbloodcelllysisweresuperiortothewholebonemarrowculturebythecellsviabilityandprimaryculturetime，thesignificantdifference(p<0.05);24hinliquidtimeneededforeachgenerationtoextendthetimeforthefirsttimetheextremelysignificantdifferencecomparedwithothergroups(P<0.05),asthebesttimeoftheliquidforthefirsttime,cansignificantlyreducethecycleofthecellculture;Attheendofthefirst-stepstrategy,thecellmorphologyhadnoobviouschange,andpartofcellsbecomeround,DTZstainingnegative,anyspecificgenemRNAexpressionwasdetected.Afterinducted7days,BMSCsgraduallymergedtoformcluster,DTZstainingpositive,onlyPDX-1mRNAexpressionwasobserved,whichwasverifiedasinsulinprogenitorcells.Attheendofsecond-stepstrategy,thenumberofdifferentiatedcellsclusterwasincteased,RT-PCRshowedthatPdx-1andInsulinwereexpressed.Afterinducted19days,cellclusterslooklikeislet-likestructureinterminal,DTZstainingpositiveanddetectedPdx-1、Insulin、Nkx6.1expression.ImmunocytocheemistryanalysisshowedexpressionofPDX-1intheislet-likeclusters.TheinsulinconcentrationsofBMSCsgroupandinducedgroupwere（27.86±0.034µIU/mL）、（29.33±0.48µIU/mL）、（29.92±0.46µIU/mL）、（31.32±0.03µIU/mL）and20.54±0.21µIU/mL）、（22.10±0.45µIU/mL）、（22.36±0.35µIU/mL）、rdthththth（23.39±0.20µIU/mL）atthe3、7、11、15、19days,andthedifferencewasveryrdsignificant(P<0.05)betweenBMSCsandinducedgroupsexceptthe3days.【Conclusion】Showthattheredbloodcelllysismethod,24hforthefirsttimeinliquidcanimprovetheactivityofbonemarrowmesenchymalstemcells,shortenthecycleofcellculture;ItillustratedthatisolatedandpurifiedBMSCsinvitrocanbeinductedtodifferentiateintofuctionalmatureisletcells.【Keyword】bonemarrowmensenchymalstemcell;redcelllysis;wholebonemarrowculture;growthfactor;pancreaticisletcell;differentiation;rabbit43