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《实时荧光taqman探针设计的几个要点》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验室很多同学都耍做RealtimePCR实验，实验室的师兄师姐都会冇很多宝贵意见，不过也冇实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光TaqmanW设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。忖前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能戢传递探针)和分子信标MolecularBeacon。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针,该探针只与模板特异性地结合，其结合位
2、点在两条引物之间。探针的5端标记有荧光报告妹团(Reporter,R),如FAM、VIC等，3端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q),如TAMRA等。当探针完整的时候，5端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3,端荧光某团淬灭，仪器检测不到5,端报告基团所激发的荧光信号(就是说5'荧光基团的发射波长正好是3'荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3”荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程屮遇到与模板结合的探针，瓦5'・3,外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5,端报告基团游离于反应体
3、系中，远离3,端荧光淬灭基团的屏蔽，5,端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就冇一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。(请注总，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是TaqmanMGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM,TET,VIC,HEX等等。当探针完整的时候，由于3,端的荧光淬灭基团在吸收5,端报告基团所发射的荧光能•晟，木身会发射波长不同的荧光而导致木底高，因此TaqMan探针近來又冇新的发展一TaqManMG
4、B探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher),本身不产生荧光，可以大大降低本底侑号的强度。同时探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高109左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提离——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqManMGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术
5、利用了Taq酶5、一3、外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同吋给Taq酶5、一3、外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C,这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难于做质控检测。RealtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价一、实时荧光Taqman探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp+U对要保守的片段来设计引物与探针。叩real-timePCR的扩增片段是50bp--150bp.,当找不到150bp的
6、保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物（即上游引物）。这样，可保证在将来扩增时，即便没冇完全扩增，也冇荧光信号报告出來。两者的距离最好是探针的5'端离上游引物的3'冇一个碱基，但也可以重叠。若在原序列中找不到合适的探针与引物（1主要是探针和卜-游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时;2突变位点要求在探针的5'端也能检测到荧光信号，但却是在3'端），可在互补的序列中设计引物与探针。另real-timePCR中的探针和引物的Tm值，均耍高于
7、平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。二、探针的设计探针设计的基本原则：1.保守：探针要绝对的保守，冇时分型就单独依靠探针來决定。理论上冇一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基故好在探针的中间，对探针与H的片段的杂交影响不大，不相同的碱肚最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T,而不能为G或A,因为A、T为双键，而G、A为三键。2.探针长度:Taqman探针的长度最好在25-32bpZ
8、Rj,11Tm值在6&72°C之间，最好为70°C,确保探针的Tm值要比引物的TmffirStB
9、10eC,
