苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量

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1、园艺学报，2015，42(7)：1400–1408.ActaHorticulturaeSinica1400doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0161；http：//www.ahs.ac.cn苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立1,21,*2,*1秦子禹，孙建设，王娜，邵建柱12（河北农业大学园艺学院，河北保定071001；河北科技师范学院园艺科技学院，河北昌黎066600）摘要：为建立一种检测苹果茎痘病毒（Applestempittingvi

2、rus，ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法，根据ASPV外壳蛋白基因（coatprotein，cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针，以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996，扩增效率为99%；该方法特异性好，与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿2-1叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应；其最低检测限为1.31×10copies·μL，灵敏度比常规RT-PCR高100倍；

3、批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。关键词：苹果茎痘病毒；TaqMan探针；实时荧光定量RT-PCR中图分类号：S661.1文献标志码：A文章编号：0513-353X（2015）07-1400-09DevelopmentofaTaqManReal-timeRT-PCRMethodforDetectingApplestempittingvirus（ASPV）1,21,*2,*1QINZi-yu，SUNJian-she，WAN

4、GNa，andSHAOJian-zhu12（CollegeofHorticulture，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding，Hebei071000，China；HorticulturalCollegeofScience&Technology，HebeiNormalUniversityofScience&Technology，Changli，Hebei066600，China）Abstract：ThisstudyestablishedaTaqManreal-timeRT

5、-PCRmethodfordetectingApplestempittingvirus（ASPV）.ApairofprimersandaTaqManprobeweredesignedbasedontheconservednucleotidesequenceofASPVcoatproteingene（cp）.TheRNAstandardofASPVwaspreparedwithtranscriptioninvitroandthestandardcurvewasplotted.Thespecificity，se

6、nsitivityandreproducibilityofthismethod2wereevaluated.Theresultsshowedthatthecoefficientofdetermination（R）was0.996andtheamplificationefficiency（E）was99%.TherewasnocrossingreactionwithApplestemgroovingvirus（ASGV），Applechloroticleafspotvirus（ACLSV）andApplesc

7、arskinviroid（ASSVd），indicatinga2-1strongspecificity.Thedetectionlimitofthismethodwas1.31×10copies·μLandthesensitivitywas100timeshigherthantheconventionalRT-PCR.Thecoefficientsofvariationbetweentheintra-andinter-assaywerebothwithin1.85%.Thismethodcouldbeuse

8、dtodetectASPVrapidlyandquantitativelyinfieldsampleswithstrongspecificity，highsensitivityandreliablereproducibility.收稿日期：2015–03–04；修回日期：2015–05–20基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-28）*通信作者Authorforcorrespondence