猪流感病毒h1n1亚型单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制

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1、山东农业大学硕士学位论文猪流感病毒H1N1亚型单克隆抗体的制备与胶体金试纸条的研制姓名：王校伟申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：谢之景20120615山东农业大学硕士学位论文中文摘要本研究用猪流感病毒H1N1亚型对9．11日龄鸡胚进行尿囊腔接种，剂量为1009F枚，培养72小时后收集鸡胚尿囊液，HA试验检测其HA血凝效价为28。用4％的甲醛对新培养的H1NI亚型病毒进行灭活，然后免疫6．8周龄的BALB／C，每只小鼠免疫灭活H1N1亚型流感病毒150ul／只，以后每隔14d加强免疫一次，在二次免疫后10d取尾静脉血，利用HI试验检测其HI抗体效价为26，取免疫

2、小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2／0进行细胞融合。建立筛选阳性克隆细胞的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选方法，确定包被抗原的最佳稀释倍数为1：100，4℃包被过夜，以1：800稀释阴阳性血清作为阴阳性对照，反应条件为37℃1．5h效果最佳，酶标二抗l：3000稀释最佳反应时间为1h。用所建立的iEMSA筛选方法对融合的杂交瘤细胞进行筛选，结果共获得阳性杂交瘤细胞24株。利用有限稀释法对阳性细胞株进行亚克隆，(每株单抗至少有两次为单个克隆)后，用iELISA进一步检测筛选，最终获得9株能稳定分泌抗H1N1亚型抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为A10、D1、D3、E2、E4、

3、H1、H8、G5、G7。对这9株单克隆抗体用讵LISA分别进行了腹水效价、特异性、抗体亚型进行了检测，结果如下：A10、D1、H8的抗体效价为51200，D3、G5为3200，E2、H1、G7的抗体效价为12800，E4的抗体效价为25600；特异性良好，其中A10、D3、E2、FA、HI、H8、G5、G7均与血凝素H1呈阳性反应，D1与神经氨酸酶N1呈阳性反应。与其它HA亚型流感病毒、NA亚型流感病毒以及非流感病毒均不反应；经亚型鉴定，A10、H1为IgG2a，G7为IgM，D1、D3、E2、E4、H8、G5均为IgGl；用吉姆萨染液染色对克隆细胞株进行染色体计数，结

4、果染色体他数目均介于100．110之间，具有杂交瘤细胞典型的染色体特征。为制作胶体金检测试纸条选择配对抗体，对所获得的克隆株进行了抗原位点检测，经抗原位点检测显示D3与G5，E4与H8对应病毒的相同抗原位点，其他单克隆抗体均对应不同的抗原位点，其中A10与D1的叠加系数(触)值为90．5％，配对关系良好，所以选择用A10与D1制备检测H1N1亚型流感病毒的胶体金试纸条。用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒，通过对于A10株单抗腹水的稀释确定了胶体金的最低稳定量，成功制备了金标抗体，经过不断摸索确定了NC膜的最佳包被单抗为D1．包被浓度为1：2稀释，羊抗鼠的酶标二抗的包被浓度为

5、1：20稀释。分别选择CB06、KL43制备胶体金试纸条的样品垫和金标垫。对所研制的试纸条进行了特异性、敏感性●●l一●猪流感病毒HINI亚型单克隆抗体的制各与胶体金试纸条的研制检测，结果如下：本试纸条除与H1N1亚型特异性反应外，不与其他亚型的HA和NA起反应；本试纸条检测血凝效价为(O．5l092)灵敏度高于HA试验，但是低于RT-RCR试验(O．251092)。用本试纸条与RT-RCR同时对98份样品进行检测，结果二者的符合率高达81．6％。结果表明本试验制备的试纸条特异、敏感，可用于H1N1猪流感病毒的快速诊断。关键词：猪流感病毒：H1N1：单克隆抗体：胶体金2

6、山东农业大学硕士学位论文AbstractSubtypeH1N1ofswineinfluenzavirus(Sly)wereinoculatedinto9—11-day—oldchickenembryos，dosefor100ul／pieces，andincubatedfor72hours．HAassayswereperformedtodetectthattheHAtiterwas1：256．BALB／Cmicewereimmunizedwith4％formaidehydeinactivatedvirusandinactivated150肛1each，thentheywe

7、reboostedimmunizationevery14days．Thetailveinbloodwascollectedanddetectedtheantibodylevelsofhemagglutinationinhibitiontitersof1：64after10daysofsecondaryimmune．ThespleencellsfromimmunizedmicewerefusedwithSP2／0myelomacells．Indirectenzymelinkedimmunosorbentassay(iELISA)usedto