猪流感病毒h1亚型ha蛋白特异性单克隆抗体的研制

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1、猪流感病毒H1亚型HA蛋白特异性单克隆抗体的研制：李洪涛,刘明,刘春国,杜金玲【摘要】　　目的:研制猪流感病毒抗H1亚型HA特异性单克隆抗体(mAb)。方法:构建H1亚型猪流感病毒A/SAb的反应性和特异性。结果:共获得3株分泌抗H1亚型猪流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为8C4、8C6、9D6。mAb腹水ELISA效价在1∶16000～1∶256000之间;HI效价为1∶512～1∶256000;对A/SAb只与H1亚型猪流感病毒HA蛋白反应。结论:HA蛋白特异性mAb的研制为H1抗原变异分析及H1亚型猪流感诊断方法的建立奠定了物质基础。【关键词】猪流感;基因免疫;单克隆抗体;

2、血凝抑制　　［Abstract］AIM:Topreparethemonoclonalantibodies(mAb)againsttheHAproteinofsubtypeH1ofsidsubtypeH1ofSIVHAgeneofA/Siceof6-8munizedendemicallyid.Thesplenocytesfromtheimmunizedmiceyelomacellsafterthelastimmunization.Hybridomacellsagglutinationinhibition(HI)tests.TheactivityandspecificityofmAbsace

3、lllinessecretingspecificmAbsnamed8C4,8C6,and9D6AbsedthatmAbsonlyreactedAbscanbeusedasausefultooltoanalyzetheantigenicvariation.TheyalsoprovidetheeffectivereagentsfortherapiddetectionofsubtypeH1ofSIV.　　［Keymunization;monoclonalantibody;hemagglutinin　　猪流感是规模化养猪场普遍存在且难以根除的猪群发性疾病,不仅可直接引起患猪死亡,而且使猪群生产性

4、能下降,对养猪业危害极大。更值得重视的是,猪流感病毒（sAb）以其特异性高、敏感性强被广泛用于各类疾病病原的血清学检测和诊断中［2］。在动物体内由于免疫力的作用,流感病毒表面血凝素基因(hemagglutinin,HA)非常容易发生抗原漂移［3］,常导致待测病毒与标准检测抗体的交叉反应性差,给检测工作带来许多困难。因此,研制针对SIVHA蛋白mAb,对快速准确地检测SIV具有重要的应用价值［4］。另外HA蛋白因其具有良好的免疫原性使其成为基因工程疫苗的首选［5］。　　1材料和方法　　1.1材料　　A/Sa公司;mAb亚型鉴定试剂盒购自SouthernBiotech公司;次黄嘌呤氨基蝶呤

5、胸苷培养基（HAT）、次黄嘌呤胸苷培养基(HT)购自Gibco公司;细胞培养用牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;其他普通生化试剂均为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1引物设计与合成　　参照GenBank上已发表的H1亚型SIVHA基因序列设计引物,序列:P1:5′CGCGCTAGCATGAAGGCAATACTAGTGTTC3′,P2:5′CGCTCGAGTTAGATCGCCAAAATTTGGTAAAT3′由上海博亚生物技术有限公司合成,预计目的片段长度1700bp。　　1.2.2H1HA基因PCR扩增　　按常规PCR方法扩增,程序为:94℃4min,94℃3

6、0s,54℃30s,72℃2min,30个循环后,72℃10min。扩增产物10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　1.2.3重组质粒的构建　　PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后与pCIneo质粒分别用NheⅠ/XhoⅠ双酶切,酶切产物电泳回收纯化、连接后、转化DH5α感受态细胞,37℃摇床培养1h,涂Amp平板,37℃温箱过夜培养,挑单个菌落接种于LB液体培养基,PCR鉴定。扩大培养阳性菌,用质粒抽提试剂盒抽提重组质粒,用NheⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定。　　1.2.4抗原制备及免疫　　按文献［6］所述的方法制备抗原。根据文献［7］免疫方法稍作改进,以25μg/只肌肉免疫6周龄小鼠,每隔2周

7、免疫1次,共免疫3次。融合前3d全病毒加强免疫1次。　　1.2.5间接ELISA方法的建立　　采用方阵法确定抗原最佳包被浓度、二抗最佳工作浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、被检血清最佳稀释度、待检血清反应时间、酶标二抗反应时间、底物反应时间,间接ELISA方法阴性值和阳性值临界值的确定。　　1.2.6细胞融合及筛选　　饲养层细胞、免疫脾细胞的制备以及细胞融合按参考文献［8］进行。当杂交瘤细胞生长至1/3～1/2孔底面积时,吸取上