cgrp及其受体亚单位ramp1对血管平滑肌细胞增殖的调控作用

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1、遵义医学院硕士学位论文CGRP及其受体亚单位RAMP1对血管平滑肌细胞增殖的调控作用姓名：崔璨申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：石蓓；赵然尊201205遵义医学院硕士学位论文CGRP及其受体亚单位RAMPl对血管平滑肌细胞增殖的调控作用CGRP及其受体亚单位I认MPl对血管平滑肌细胞增殖的调控作用中文摘要目的和背景血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)存在于血管中膜，正常情况下能够合成分泌胶原蛋白并通过轻度收缩以维持血管壁的张力。研究表明VSMCs的异常增殖和迁移在高血压、动脉粥样

2、硬化及经皮冠状动脉介入治疗(PercutaneousCoronaryIntervention，PCI)术后血管内再狭窄等的病理过程中起着重要作用。新近针对干细胞移植治疗的研究发现，间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)的移植有一定的促进损伤动脉内皮修复和抑制新生内膜增生的作用，但对抑制平滑肌增殖无直接作用。因此，如何通过相关基因修饰或改造MSCs，使之发挥最大效应，是下一步的研究需要解决的主要问题。有研究显示，降钙素基因相关肽(CalcitoninGene．relatedPeptide，CGI冲)与受

3、体结合，在体内外均有抑制VSMCs增殖的作用，并逆转动脉重塑。VSMCs中已被证实有大量的CGRP受体表达，但CGRP并不能单独与受体结合，它需要受体活性修饰蛋白(ReceptorActivityModifyingProteins，RAMPs)的介导才能发挥作用，RAMPl是RAMPs家族中的一种，在VSMCs中检测到RAMPl受体的表达。本课题组前期实验研究显示：RAMPl修饰的MSCs能够抑制球囊损伤后中膜VSMCs增殖，促进损伤血管快速内皮化，减轻损伤血管后炎症细胞因子的表达，抑制内膜增生，从而减轻血管成形术后的再狭窄，但

4、具体作用环节及机制尚不明确。我们推测上述结果可能与RAMPl抑制VSMCs增殖有关，而此抑制作用最终可能是RAMPl通过对CGRP的调控而实现的。为了验证上述推测，本研究拟通过构建高表达RAMPl的VSMCs和沉默RAMPl的VSMCs，观察RAMPl对VSMCs增殖的影响，并在此基础之上采用CGRP与1LAMPl共干预的方法进一步探讨RAMPl对VSMCs的作用机制是否是通过调节VSMCs对CGRP的敏感性而实现的，同时测定携带CGRP的慢病毒转染MSCs后，MSCs中CGRP的分泌量，之后通过与VSMCs共培养的方法观察高表

5、达CGRP的MSCs是否能够稳定发挥CGRP的生物学效应，以期为本课题组下一步利用以CGRP为目的基因修饰的MSCs治疗血遵义医学院硕士学位论文CGRP及其受体亚单位RAMPl对血管平滑肌细胞增殖的调控作用管成形术后再狭窄的体内研究，提供更为充分的前期实验准备。方法第一部分分别构建高表达RAMPl慢病毒载体(Lenti．GFP．RAMPl，简称RAMPl叫+)、沉默RAMPl慢病毒载体(Lenti．GFP．shRAMPl，简称RAMPl小)及空病毒载体(Lenti—GFP，简称GFP州+)，分离获得大鼠胸主动脉VSMCs，细胞培

6、养经同步化后，将上述已成功构建的慢病毒载体分别转染至VSMCs，实验分为四组：RAMPl叫+转染VSMCs组(简称VSMCsm鲥vtPl卅组)、RAMP1乒转染VSMCs组(简称VSMCs洲P1√·组)、GFP卅+空病毒转染VSMCs组(简称VSMCsC肼件组)和VSMCs对照组，每组又分为24h、48h、72h和96h共4个亚组。分别应用流式细胞技术测定慢病毒的转染率；ELISA法测定不同时间点各亚组RAMPl的蛋白分泌量以确定最佳感染时间点；应用RT-PCR和Westernblot技术分别检测各组VSMCs中RAMPl的基因

7、和蛋白表达水平。此外，在慢病毒转染后6h加入AngII诱导细胞增殖以模拟血管内VSMCs增殖模型，应用MTT法、流式细胞技术和Westernblot技术检测各亚组细胞的增殖、凋亡、周期变化以及收缩蛋白0【一SM—actin(a．SmoothMuscleAntibody#．SM．actin)、合成型蛋白骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的表达变化；细胞划痕实验观察各组VSMCs的迁移能力。第二部分CGRP蛋白直接接触法：为了观察RAMPl在CGRP抑制VSMCs增殖过程中的作用途径，以一定浓度的CGRP蛋白干预上述VSMC

8、sRAMPl+件、VSMCsRaMPl‘7‘及正常VSMCs；实验分组如下：VSMCs对照组、CGRP+VSMCs组、CGI冲+VSMCs删P1卅组、CGRP+VSMCsR-削vlPl乒组。分别应用MTT法和流式细胞术技术检测各组VSMCs的增殖、凋亡及周期变化