兔角膜缘干细胞原代培养的研究

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1、兔角膜缘干细胞原代培养的研究计：学位论文：37页表格：O个插图：9幅房传凯指导教师：马翔教授申请学位级别：硕士学位专业名称：眼科学论文提交日期：2012年4月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位：大连医科大学学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明lIHlilllllMIIIIilllilllY2283150本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工

2、作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：赶弛签字日期：趔丝年』月监日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)日lJ吾⋯⋯”⋯⋯⋯⋯⋯⋯”⋯⋯”⋯⋯⋯”⋯⋯”“⋯⋯“⋯⋯‘5(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(三)结果⋯⋯⋯⋯000⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOOOOOOOO⋯⋯⋯⋯24(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32四、附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOOOOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37兔角膜缘干细胞原代培养的研究硕士生姓名：指导教

4、师：指导小组：专业名称：房传凯马翔教授眼科学摘要目的：通过对兔角膜缘干细胞的体外培养，观察细胞的形态学，建立兔角膜缘干细胞在体外的培养及鉴定方法。为临床上应用角膜缘干细胞治疗相关性疾病提供了理论依据及实验基础。方法：大连医科大学实验动物中心提供的兔子。按照所取的组织块大小，将其分为两组：I组为5只眼，在显微镜下取兔的一小块角膜缘组织，大小约为lxlmlTl。II组为5只眼，取大小约为2x2111111的角膜缘组织。两组均采用相同的方法及培养条件对细胞进行培养。将角膜缘组织用0．25％胰蛋白酶进行消化，加入含有20％胎牛血清、100u／ml青霉素和100lag／ml链霉素配成

5、的双抗混合溶液(两者的比例为1：1)以及10ng／ml的EGF生长因子的DMEM培养液，放入C02培养箱(5％C02，37℃)培养。应用光学显微镜对培养的细胞以及其生长情况进行观察，并应用角蛋白K3的单克隆抗体AE5对培养的细胞进行免疫化学鉴定。在体外对兔角膜缘干细胞进行培养，运用显微镜对培养的细胞以及其生长情况进行观察，应用角蛋白K3的单克隆抗体AE5对培养的细胞进行免疫化学鉴定。结果：本实验首先在I组5只兔眼的小组织块角膜缘上方的大小约lxlmm，去除上皮后获取前部基质层(厚度大约为100lam至150lam)，对组织块进行体外培养，均无细胞生长。探寻无细胞生长的原因，

6、在II组5只兔眼我们取的是2x2mm大小，厚度与前相同的角膜缘组织块采用完全相同的方法进行培养，观察显示有细胞生长。对2x2mm的角膜缘组织块生长2—3天后对其细胞的生长情况以及形态进行观察。细胞生长第2—3天时对其进行观察发现：细胞从组织块边缘移行出，形成“沙滩样”移行带，细胞之间排列比较紧密。培养至第6天时，细胞几乎贴满瓶底，细胞体积较小，卵圆形或多边形为主，细胞核为单核或多核，核质比例大。应用角蛋白K3的单克隆AE5抗体对培养的细胞进行染色，染色呈阳性的细胞为大多数，即是角膜上皮细胞，而染色呈阴性的少数细胞为角膜缘干细胞。结论：1组织块培养法：lxlmm大小，去除上皮

7、后获取前部基质层(厚度大约为100um至150um)，对组织块中几乎无细胞生长，而2x2mm大小，厚度与前相同的角膜缘组织块经过培养则含有角膜缘干细胞，但干细胞数量比较少。2．单克隆抗体AE5可以与角蛋白K3特异性结合，其可用于对角膜缘干细胞鉴定方法之一。关键词：兔角膜缘干细胞体外培养鉴定2TheresearchaboutrabbitcorneallimbalstemcellsinprimarycultureMaSterde伊eecandidate：FangChuankaiSupervisor：ProfessorM