兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究.doc

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1、兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究【摘要】目的:建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性。方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT比色法测定细胞生长曲线。结果:两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛（P<0.05）；在16h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法（P<0.05）。结论:选择组织块培养法培养兔角膜上

2、皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。【关键词】角膜；上皮细胞；原代细胞培养；兔角膜细胞成分培养是现代角膜病研究和治疗的基础，近年来，随着研究深入，对角膜细胞成分培养提出了更高要求。在此，我们探索了体外原代培养兔角膜上皮细胞的两种方法，以期建立一种简单、经济、实用的兔角膜上皮细胞培养方法，现将实验结果报告如下。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物健康新西兰白兔6只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg,由东南大学实验动物中心提供与饲养。眼部经裂隙灯显微镜检查显

3、示屈光间质透明，无眼前节病变。1.1.2主要试剂和仪器DMEM/F12（Gibco,USA)，胎牛血清（中美合资兰州民海生物），胰蛋白酶（Gibco,USA），EDTA（乙二胺四乙酸二钠，AMRESCO分装），MTT（Sigma，USA），CO2培养箱（HealForceHF121UV），倒置相差显微镜（OLYMPUSCKX41，Japan），酶标仪（Bio-radModel860）。1.1.3培养液的制备采用DMEM/F12=1∶1的混合液，内含10mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和

4、100×103U·L-1链霉素，pH值7.2～7.4。71.2实验方法1.2.1取材取新西兰白兔6只，共12眼，以空气栓塞法处死兔，无菌条件下迅速摘取眼球，用PBS反复冲洗后浸泡于含青、链霉素1000×103U·L-14℃PBS中10min,待用。1.2.2消化法原代培养角膜上皮细胞在超净工作台上将眼球用PBS冲洗2～3次，沿角膜缘取下完整角膜，用DMEM/F12培养液冲洗1～2次；在50mm培养皿中加0.25%胰蛋白酶或0.1％胰蛋白酶－0.02％EDTA混合消化液约1ml，将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培养

5、箱中消化20～30min后翻转角膜片，轻轻冲洗上皮面，将冲洗液移至加有适量胎牛血清的离心管终止消化；在培养皿中再次加入消化液，置培养箱中消化10min后终止消化；将两次消化的细胞悬液离心6～8min(1000r·min-1)，弃上清，加入全培养液（内含10mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素、100×103U·L-1链霉素，pH值7.2～7.4），吹打混匀。计数制成5×105～1×106ml-1细胞悬液，接种于培养瓶中。置37℃、5%CO2和95%空气培养箱中培养，3d后首次换液，以后每周

6、更换2～3次。1.2.3组织块贴壁法原代培养角膜上皮细胞在超净工作台上，将眼球用PBS冲洗2～3次后沿角膜缘取下完整角膜，放入加有培养液的培养皿中；在体式显微镜下完整撕下角膜上皮面，剪成约1mm3大小角膜上皮片，均匀平铺于培养瓶中，翻转培养瓶加入全培养液，置培养箱中培养2～4h后轻轻翻转培养瓶，使培养液慢慢浸过组织块；或将角膜上皮片均匀平铺于24孔板中，置于培养箱中2～4h，然后缓缓加入全培养液。将培养瓶或24孔板置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养，3d后首次换液，以后每周更换2～3次。1.2.4角膜上皮细胞的传代原代培养

7、至上皮细胞80％融合后用PBS冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA1ml冲洗1次，再加入消化液1～2ml，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的培养液终止消化，收集细胞悬液，离心6～8min(1000r·min-1)，计数，接种于培养瓶中（按1∶2或1∶3传代），3d后首次换液，以后每周更换2～3次，直至细胞融合。1.2.5观察方法1.2.5.1形态观察每日用倒置显微镜观察活细胞生长情况，拍照记录。1.2.5.2MTT法测定细胞生长曲线7取生长状态良好的上皮细胞，采用上述

8、传代方法消化，制成细胞悬液，计数，以103ml-1接种于96孔板，每板设复孔且每孔的细胞数保持一致，加入等量培养液（200μl·孔-1）置培养箱中培养；每天取出1块板，每孔加入MTT溶液（5mg·ml-1）20μl，培养箱中继续培养4h后终止培养，小心吸弃培养上清液，每孔加入