结核分枝杆菌cfp10-ppe68融合蛋白表达及其在结核病诊断中的初步应用

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1、重庆医科大学硕士学位论文结核分枝杆菌CFP10--PPE68融合蛋白表达及其在结核病诊断中的初步应用姓名：董志玲申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：杨春201205重庆医科大学硕士研究生学位论文结核分枝杆菌CFP10-PPE68融合蛋白表达及其在结核病诊断中的初步应用1摘要目的：构建结核分枝杆菌CFPl0一PPE68融合基因原核表达质粒，在大肠杆菌BL21中观察CFPl0一PPE68融合基因的表达，并用亲和层析法分离纯化重组蛋白；用纯化的CFPl0一PPE68重组蛋白作为诊断抗原，间接ELISA法检测临床诊断为肺结核病人和肺外结核病人血清标本中相

2、应抗体，并判断其特异性、敏感性和准确性。为结核病的早期诊断提供新的思路。方法：1．以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，用PCR方法分别扩增CFPl0和PPE68基因，然后用基因拼接法扩增CFPIO—PPE68融合基因，将其克隆至pET32a(+)载体中，构建重组的原核表达质粒pET32a(+)／CFPl0一PPE68，转化至E．coliBL21中，经IPTG诱导表达后，对表达产物进行鉴定。2．将纯化的CFPl0一PPE68重组蛋白作为诊断抗原，间接ELISA法检测临床诊断为肺结核病人(251例)、肺外结核病人(66例)和健康体检者(52例)共36

3、9例血清标本中相应抗体，并判断其特异性、1本课题由国家自然科学基金(30771922，30901280)，重庆市自然科学基金(2009BB5275)资助3重庆医科大学硕士研究生学位论文敏感性和准确性。结果：1．重组的原核表达质粒pET32a(+)／CFPl0一PPE68双向测序结果显示与CFPl0一PPE68基因编码序列完全一致，表达产物可见相对分子质量约68000的蛋白条带，为CFPIO(相对分子质量10900)、PPE68(相对分子质量37330)与Trx．His(相对分子质量20400)的融合蛋白条带。2．CFPl0一PPE68重组蛋白作为诊断抗原

4、，以临床诊断为金标准，52例健康体检者为阴性对照，检测肺结核病人和肺外结核病人结核分枝杆菌感染的敏感性分别为98．4％，98．3％，特异性分别为27．6％，85．0％，准确性分别为56．1％，91．5％。结论：1．成功的将结核分枝杆菌特异性基因CFPIO、PPE68融合克隆入原核表达质粒pET32a(+)中，并在E．coliBL21中成功表达。2．CFPIO—PPE68蛋白作为诊断抗原，诊断结核分枝杆菌感染，特别是对难以诊断的肺外结核病诊断有一定参考价值。关键词：结核分枝杆菌；CFPIO—PPE68；原核表达；融合蛋白；EI．ISA重庆医科大学硕士研究生

5、学位论文EXPRESSIONANDAPPLICATIONOFCFPl0一PPE68FUSl0NPROTEINOFMYCOBACTEIUUMTUBERCULOSISABSTRACTToconstructaprokaryoticexpressionplasmidcarryingtheCFPIO—PPE68fusiongeneofMycobacteriumtuberculosis，andobservetheexpressionofCFP10一PPE68fusiongeneinE．coliBL21，thenpurifytheCFPIO—PPE68proteine

6、xpressedinE．coilBL21byaffinitychromatograph．ThepurifiedCFP10一PPE68recombinantproteinwastakenasantigentodetecthealthyandpatients,includingmycobacteriumtuberculosisandextrapulmonarytuberculosispatients(n=66)．Thesensitivity,specificityandaccuracyweremeasured．Itprovidesanewideaforthe

7、earlydiagnosisofMethods：1．ThePPE68andCFP10genewereamplifiedbyPCRfromthegenomeofmycobacteriumtuberculosisH37Rvstrain，theCFP10一PPE68fusiongenewasamplifiedbyGeneSOEing，andclonedintopET32a(+)vector，thentransformedintoE．coliTopl0．Afteridentifiedbyrestrictive5重庆医科大学硕士研究生学位论文digestionan

8、dDNAsequencing，theconstructedrecombinant