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《结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、中国防痨杂志2001年第23卷第2期·85··论著·结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用111111吴雪琼,张俊仙,李洪敏,夏湘萱,刘 军,金关甫摘要:目的 获得重组MPT64蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白,通过Westernblotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET15b2MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外,其余密码子均与报道的相同,但其氨基酸序列无变化。它在大肠
2、杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的20～30%,分子量约26kDa,Westernblotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS2PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80%左右,每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值+2S为正常界限值,PDD的特异性和敏感性分别为94%(31/33)、63.7%(21/33)、66.7%;rMPT64纯化蛋白分别为94%(31/33)、30.3(10/33);一步法分别为88%(29/33)、66.7%(22/23)。结论 pE
3、T15b2MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。关键词:抗原;MPT64蛋白; 基因表达; 血清学诊断; 分枝杆菌,结核ExpressionofMPT64proteinofMycobacteriumtuberculosisinEscherichiacolianditspurificationapplication.WUXue2qiong,ZHANGJun2xian,LIHong2min,etal.TuberculosisResearchLaboratory,
4、The309thHospital,Beijing100091Abstract:ObjectiveToobtaintherecombinantMPT64protein,tostudyitsimmunologicalcharacteristics,andtoevaluateitspotentialvalueforserodiagnosisoftuberculosis.MethodsThegenecodingMPT64proteinin2sertedintoaexpressionvectorpET215b,andthentransferredtoE.coliBL21(DE3).Theexpr
5、essedproductwaspurifiedbymetalchelationchromatography,andanalyzeditsimmunogenicitybywesternblotting.66humanserumwasdetectedtheantibodiesagainstM.tuberculosisrMPT64andPPDantigensbyELISA,andantibodiesagainstM.tuberculosisantigensbytuberculosisone2steptest.ResultsSequencingrecombinantplasmidpET215b
6、2MPT64showedthattherewasamutation(CCA→CCG)atcodon83,butitsaminoacidhadnochange.There2combinantMPT64proteinexistedininclusionbodiesofE.coli,andamountedto20～30%oftotalbacterialpro2teins.Itsmolecularweightwasabout26kilodalton.ItcanproducegoodimmunoreactivitywithserumfromgoatsvaccinatedwithM.tubercu
7、losisbywesternblotting.Thepurityoffinalproductwasabout80%.10mgofrMPT64proteinper100mlculturecouldbeobtained.ThepositivecutoffvalueswereOD492plus2standarddeviationof33negativeserumdetectedbyELISA.Of33serumfromtuberculosispati
