羊传染性脓疱病毒vir基因的序列分析及pcr检测方法的研究

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1、分类号S852.4学校代码10129UDC11.220学号2009201092羊传染性脓疱病毒VIR基因的序列分析及PCR检测方法的研究SequenceAnalysisoftheVIRGeneandconstructionofaPCRAssayofContagiousEcthymaVirus申请人：徐华敏学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学指导教师：申之义教授论文提交日期：二〇一二年五月摘要根据GenBank中已经发表的羊传染性脓疱病毒毒株NZ2株的VIR基因序列，设计合成1对引物。采用PC

2、R技术对内蒙古分离株OV/nm-05的VIR基因进行特异性扩增，然后将其克隆到pEASY-T1载体中。将经过PCR鉴定和酶切鉴定后的阳性重组质粒进行测序，得到大小为779bp的核苷酸片段，其中完整的VIR基因长为552bp。序列分析表明，OV/nm-05株与1710/03株同源性最高，达98.0%，与513/04株的同源性最低，为95.4%，与其他8株参考毒株的同源性都在95.5%以上，说明羊传染性脓疱病毒各株之间VIR基因的差异不大。用上述引物进行PCR退火温度的优化。采用该PCR方法对OV/nm-05株、犊

3、牛睾丸细胞和山羊痘病毒GVX/nm株的DNA进行PCR扩增，结果只有OV/nm-05株能扩增出相应的片段，其余均为阴性，说明该PCR反应体系具有良好的特异性；对OV/nm-05株的DNA模板10倍梯度稀释后进行PCR扩增，结果最低可检测出38pg的模板，说明该PCR反应体系具有较高的敏感性。关键词：羊传染性脓疱病毒；VIR基因；克隆；序列分析；PCR检测SequenceAnalysisoftheVIRGeneandconstructionofaPCRAssayofContagiousEcthymaVirusAb

4、stractAccordingtothepublishedVIRgenesequenceofCEV(strainNZ2)inGenBank,onepairofprimerwasdesignedandsynthesized.ThentheVIRgeneofOV/nm-05isolatedinInnerMongoliawasamplifiedbyPCRandclonedintopEASY-T1vector.Beforesequenced,therecombinantplasmidobtainedwasdentifi

5、edbyPCRandrestrictionendonucleasesanalysis.Theacquiredsequencewhichcontainedthe552bpcompleteVIRgenewas779bp.ThehomologyofnucleotidesequencesanalysisshowedthatOV/nm-05sharedhighestidentity(98.0%)with1710/03andlowestidentity(94.2%)with513/04.Theresultsdemonstr

6、atedthattherewasalittlevariationamongdifferentstrains.Theannealingtemperaturewasoptimizedwiththeprimersmentionedearlier.TodeterminethatthePCRmethodwasspecific,theDNAofOV/nm-05,calftestiscellandgoatpoxvirus(strainGVX/nm)wereallamplifiedwithbyPCR.OnlyOV/nm-05w

7、asamplifiedapproximately779bpandotherswerenegative.AfterthetemplateofOV/nm-05was10timesgradientdilution,thetemplatewasamplified.TheminimumdetectionlevelofDNAwas38pg.TheresultdemonstratedthatthePCRmethodwashighsensitivity.Keywords：CEV；VIRgene；clone；sequencean

8、alysis；PCRDirectedby:prof.SHENZhiyiApplicantforMasterdegree:XUHuamin(Preventiveveterinarymedicine)(CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot100018,China)目录1引言.......