羊传染性脓疱病毒微滴数字PCR检测方法.pdf

《羊传染性脓疱病毒微滴数字PCR检测方法.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、ICS11.220B41团体标准T/CVMAX3—2019羊传染性脓疱病毒微滴数字PCR检测方法MethodofDropletDigitalPCRforOrfVirusCVMA中国兽医协会2019-XX-XX发布2019-XX-XX实施中国兽医协会发布T/CVMAX3—2019前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准不涉及专利。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林省动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：邵洪泽、王楠、原霖、于钦磊、马晓媛、高春生、白翠、呼延含蓉、董航、任锐、王欣宇、李昱洁、张兴菊

2、、宋天辉。CVMA中国兽医协会IT/CVMAX3—2019羊传染性脓疱病毒微滴数字PCR检测方法范围本标准规定了羊传染性脓疱病毒微滴式数字PCR检测方法的试剂与耗材、仪器与设备、样品、操作步骤、结果分析。本标准适用于羊传染性脓疱病毒核酸的检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术要求原理微滴式数字PCR（DropletDigi

3、talPCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应体系分成数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测，提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。CVMA试剂与耗材中国兽医协会4.1核酸提取试剂宜选取

4、商品化的病毒DNA提取试剂盒。4.2微滴式数字PCR扩增试剂与耗材宜按照不同的微滴式数字PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字PCR扩增试剂与耗材。4.3引物和探针ORF上游引物（ORFVF）：5’-TTGCACATGTCCGTGAAGAAGT-3’IT/CVMAX3—2019ORF下游引物（ORFVR）：5’-AGGCGGTGGAATGGAAAGAC-3’ORF探针（ORFVP）：5’-（FAM）-CGGGTAGTCTTTGGAGTC-（TAMRA）-3’仪器与设备生物安全柜、PCR扩增仪、数字PCR微滴发生器、数字PCR微滴分析仪、纯水仪、核酸定量仪、涡旋震荡仪。样品6.1样品的

5、采集样品采集及运输按照NY/T541的规定执行。6.2样品处理取0.1g痂皮病料按1∶1体积比加入pH7.0-7.2磷酸缓冲液。充分研磨后，制成混悬液，然后装入离心管封闭，置4℃冰箱6h，中间振荡2～3次，然后1000r/min（离心力）离心10min，取上清为待检样品。6.3样品保存采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。操作步骤7.1DNA提取CVMA按照所选取的病毒中国兽医协会DNA提取试剂盒说明书进行提取。7.2微滴式数字PCR扩增方法每个样品微滴式数字PCR扩增体系设置3个平行。微滴式数字

6、PCR扩增体系配制如表1。该步骤按照不同微滴式数字PCR平台的说明书进行操作。表1微滴数字PCR反应体系试剂成分终浓度体积2×酶混合液a1×10.0µLORFVF（10µmol/L）0.5µmol/L1.0µLORFVR(10µmol/L）0.5µmol/L1.0µLORFVP（10µmol/L）0.1µmol/L0.2µLIIT/CVMAX3—2019DNA模板/2.0µL无核酸酶水/5.8µL总体系/20µL注1：注：使用微滴式数字PCR平台进行实验时应依据不同微滴式数字PCR平台说明调整扩增体系的组分和最终体积，注2：表中所列组分的终浓度不变。注3：a微滴式数字PCR扩增试剂。

7、7.3微滴生成反应液配制后，利用微滴生成仪完成20µL反应体系的分割。7.4PCR反应微滴生成后，进行微滴式数字PCR扩增，荧光分析步骤采用FAM单荧光通道，微滴式数字PCR扩增程序（见表2）。表2微滴数字PCR扩增程序步骤温度持续时间循环数195℃5min1295℃15s40358℃1min498℃10min154℃60min1注4：升降温速度设置为2.5℃/s，不同PCR反应平台可以根据说明书对热启动步骤程序进行修改，但不能对扩增程序进行修改。7.5微