肠道病毒71型感染人脑微血管内皮细胞的机制研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文肠道病毒71型感染人脑微血管内皮细胞的机制研究Mechanismstudyofenterovirus71infectingthehumanbrainmicrovascularendothelialcells课题来源：自选课题专业名称学位申请人指导教师答辩委员会主席答辩委员会成员病原生物学罗文英曹虹教授江丽芳教授彭涛教授周荣教授黎诚耀教授芮勇宇教授论文评阅人黄平主任医师赵卫副教授吴英松教授2012年6月4日广州肠道病毒71型感染人脑微血管内皮细胞的机制研究博士研究生：罗文英指导教师：曹虹摘要一、研究背景和目的肠道病

2、毒71型(enterovirus71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属的．成员，归属于人类肠道病毒A。目前已知EV71的感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等多种与神经系统相关的疾病，严重病理症状通常在儿童中发生。自1974年Schmidt等人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为神经系统症状疾病(1969～1973年)的患者中分离到EV71，随后，世界上许多国家相继报道了EV71病毒在不同地区的流行情况，EV71病毒已在世界范围内引起多次暴发与流行。尽管EV71的基因组和生命周期相似于小核糖核酸

3、病毒科的其它成员，但相应引起的病理症状明显不同；至今尚无特异性的治疗方法及有效的针对性的疫苗预防EV71的感染，因此明确EV71的致病机制对控制婴幼儿手足口病的流行与有效治疗该疾病具有十分重要的意义。相关研究证实在EV71患者中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)的脑干、神经元等部位都己检测到EV71基因及抗原的存在，证明EV71能进入CNS。目前，对于EV71进入CNS的途径有两种理论，如同脊髓灰质炎：病毒入血穿血脑屏障或通过末梢神经沿逆轴突运输感染CNS。有关研究证实新生小鼠口服EV71后，早期可引起持续性病毒血症和

4、血脑脊液屏障通透性增加，推测摘要EV71可通过血运途径传播，但脑组织低水平的病毒数量提示血源性途径并非累及CNS的主要途径，所以EV71穿血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)机制还未明确。众所周知，BBB是循环和CNS之间一道主要的屏障，它限制着不同物质在两个部位之间的自由运输，对维持CNS的体内平衡起着一个关键的角色，故明确EV71穿BBB的机制对于防治EV71所致的CNS感染有重要意义，这亦是我们想探讨的内容。我们知道，病毒感染过程的第一步是病毒通过与位于细胞表面的特异性受体结合而吸附于被感染的细胞的表面，然后利用细胞的内吞

5、作用进入细胞或将病毒的核酸释放进细胞。所以我们推测构成BBB的主要成分之一内皮细胞可能是EV71的易感细胞，EV71与其结合而导致BBB结构改变和功能障碍，从而感染中枢神经系统。本研究采用分离鉴定的来自于重症手足口病患者的EV7l毒株感染HBMEC，形态学观察HBMEC的细胞病变、透射电镜检测HBMEC中EV71的超微结构与Real．TimePCR方法以检测HBMEC细胞培养上清液中EV71拷贝数变化情况，以探讨EV71是否能感染HBMEC并能在其中复制；且进一步检测EV71是否可以诱导HBMEC细胞骨架的改变并诱导其凋亡。最后，因为病毒成功实现

6、对宿主细胞的感染并在细胞内复制需要克服细胞对病毒感染产生的各种免疫防卫反应，阻断或影响宿主细胞的正常循环机制，利用宿主细胞的物质和能量合成病毒自身物质，这种相互作用最终会导致宿主细胞蛋白表达模式的改变，这种改变影响着宿主细胞的正常生理功能，决定和反映着病毒感染致病的进程和结果。为了研究EV71感染HBMEC后宿主细胞蛋白表达模式的改变，为揭示病毒与HBMEC的相互作用机制、病毒的分子致病机制、寻找病毒的作用靶标等研究提供有意义的信息。本研究采用2．D技术分析HBMEC感染EV71后lh、16h、24h时间点与正常HBMEC的培养上清和细胞内的蛋白

7、表达差异点，然后对差异蛋白点进行酶切，提取肽片段，最后用MALDI．TOF／TOF．MS质谱技术获得PMFMSMS图，并利用Intemet上的蛋白质数据库对肽质量进行检索，寻找具有相似肽质量指纹图的蛋白质，鉴定了差异率>2．5的蛋白。并采用免疫印迹方法进一步对其中波形蛋白(vimentin)差异蛋白的变化进行了验证。II博士学位论文二、方法l、分离与鉴定来自于临床诊断为重症手足口病患者的EV71毒株采用来自于临床诊断为重症手足口病患者的粪便或肛拭子，经肠道病毒通用型引物及EV71特异性引物检测初步诊断为EV71感染。再经RD细胞分离增殖病毒，并采

8、用EV71(226bp)引物与EV71VPl全基因序列(1086bp)引物进行RT-PCR再次鉴定，并测序与blast比对证实。2、EV