肠道病毒71型感染致小鼠脑线粒体损伤及可能机制研究

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1、0LIIIIqllllllllllllllllllqllllllllllllllllllllY2445106密级：。，．学校代码：1l。65IIIIIIIIIIIIIIIWF2814440毒量大季博士学位论文肠道病毒71型感染致小鼠脑线粒体损伤及可能机制研究指导教师学科专北名称论史提交日期论文答辩日期答辩委舞会童席吕铁钢陈宗波教授儿科学2013年4月28日2013年6月1日孙若鹏教授摘要第一部分EV71感染小鼠模型的建立及脑线粒体损伤的检测目的：建立EV71感染小鼠模型，检测感染后不同时段脑线粒体损伤情况。

2、方法：1日龄ICR小鼠120只随机分为2组，感染组(60只)每只小鼠腹腔内注射含有EV71(TCID50=104)的DMEM培养基100pl，另60只为对照组，每只小鼠腹腔注射无菌DMEM培养基1009l。观察小鼠感染后症状，并分别于病毒接种后1d、3d、5d、7d、10d、14d各用乙醚安乐死10只感染组小鼠与10只对照组小鼠取大脑。应用荧光定量RT-PCR法检测小鼠脑组织中EV71病毒载量，应用流式细胞术检测小鼠脑细胞线粒体膜电位，应用免疫组织化学法检测小鼠脑细胞胞浆中细胞色素C表达，同时应用光镜及透射

3、电镜观察脑组织病理及线粒体超微结构变化。结果：感染组小鼠于注射病毒3d候开始出现弓背、少动及后肢麻痹现象，感染5d时小鼠明显消瘦。荧光定量RT-PCR结果显示感染组3d及7d小鼠脑组织中EV71病毒载量明显高于感染5d及10d小鼠(p<0．01)，对照组、感染组1d及14d小鼠脑组织无病毒核酸检出。病理切片显示感染组3d小鼠脑组织呈空泡样改变，血管周围出现大量炎症细胞呈“套袖”样浸润，感染组5d小鼠脑组织内有胶质小结形成及噬神经细胞现象。流式细胞结果显示感染组3d及5d小鼠脑细胞线粒体膜电位显著低于对照组(

4、p<0．01)，而感染组1d、7d、10d、14d小鼠脑线粒体膜电位与对照组无显著差异(p>0．05)。免疫组化结果显示感染组3d、5d、7d小鼠脑胞浆细胞色素C阳性细胞比率明显升高。电镜结果显示对照组小鼠脑细胞线粒体膜结构完整，线粒体嵴清晰；感染组3d小鼠脑细胞线粒体略肿胀，线粒体嵴减少，感染组5天小鼠脑细胞线粒体严重肿胀，膜结构破坏，线粒体嵴变短或消失，而感染10d时脑细胞线粒体线粒体结构基本恢复正常。结论：成功建立EV71感染小鼠模型，EV71感染小鼠后，小鼠脑组织出现严重的炎症反应；EV71感染早期

5、即出现脑细胞线粒体膜电位下降及线粒体超微结构的改变，从而导致线粒体的损伤；EV71感染后期脑细胞线粒膜电位与线粒体超微结构的改变呈恢复趋势。博士研究生吕铁钢指导教师陈宗波关键词：肠道病毒71型；线粒体；膜电位；超微结构第二部分EV71感染小鼠脑线粒体损伤可能机制的研究目的：探讨EV71感染小鼠脑线粒体损伤可能的机制。方法：在己建立的EV71感染小鼠模型基础上，检测病毒接种后1d、3d、5d、7d、10d、14d小鼠脑组织中炎症细胞因子与氧化应激因子的含量。应用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测小

6、鼠脑组织匀浆液中白细胞介素(htedeukin，IL)．6与IL．1D的浓度，比色法检测脑组织中丙二醛(MDA)含量，硝酸还原法检测脑组织中一氧化氮(NO)含量，同时分析它们与线粒体膜电位之间的相关性，从炎症反应和氧化应激两个方面分析EV71感染小鼠后脑线粒体损伤的可能机制。结果：感染组3d、5d与7d小鼠脑组织匀浆液中IL．1D浓度较正常对照组明显升高(p

7、升高(p<0．01)，但与线粒体膜电位变化无明显相关性；感染组3d、5d及7d小鼠脑组织脑组织MDA含量较正常对照组明显升高(p<0．01)，感染组3d与5d小鼠脑组织NO浓度较正常对照组明显升高(萨0．01)，且脑组织MDA含量及NO浓度与脑线粒体膜电位呈负相关。结论：EV71感染过程中，IL．1p可能通过加重脑组织线粒体氧化应激反应而对线粒体功能产生损伤作用；氧化应激是导致EV71感染小鼠脑组织线粒体损伤的机制之一，MDA和NO在氧化应激导致EV71感染小鼠脑组织线粒体损伤中起到了重要作用。博士研究生吕

8、铁钢指导教师陈宗波关键词：肠道病毒71型；线粒体；炎症反应；氧化应激AbstractPartIDevelopmentofaMouseModelforEV71InfectionandMitoehondrialInjuryDetectionofbrainobjectiveToestablishamousemodelforEV71infectionanddetectmitoehondrialinjuryofthebra