乙型肝炎病毒抑制α-干扰素诱导的myd88表达的机制研究

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1、复旦大学硕士学位论文乙型肝炎病毒抑制α-干扰素诱导的MyD88表达的机制研究姓名：邬敏申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：袁正宏20070520论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：{E丛日期：论文使用授权声明口7．f．窖本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分

2、内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：女E亟兰导师签日期：．!12：￡。兰：硕士毕业论文中文摘要硕士学位论文中文摘要乙型肝炎病毒抑制洳干扰素诱导的MyD88表达的机制研究硕士生：邬敏导师：袁正宏由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirUS，HBV)感染引起的乙型肝炎是严重危害人类健康的疾病，其主要危害性在于HBV在患者体内的持续性存在易引起慢性肝炎、肝硬化，并与肝细胞癌的发生密切相关。洳干扰素(Interferon-a，lFN．a)是最早、也是目前最常用的治疗乙型肝炎的药物之一，通过诱导一系列具有抗病毒作用的效应

3、蛋白的表达，在细胞内建立起抗病毒状态，抑制病毒复制。临床资料表明IFN-a能下调病毒蛋白表达，调节免疫反应，促进抗体产生，但其单独治疗时仅30～40％的患者有较好应答。这些现象提示HBv能够拮抗IFN．a的抗病毒效应。对于HBV拮抗IFN-a的抗病毒效应的具体机制，近年来国内外众多实验室进行了研究并已获得具有一定意义的结果，如发现HBV多聚酶蛋白可干扰IFN的信号通路，抑制干扰素诱生基因的表达；慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞MxA蛋白诱生障碍，进一步研究发现HBV前Core或Core蛋白可结合MxA基因上游启动子，从而抑SdMxA蛋白表达。以上结果提示HBV与I

4、FN．a间存在相互作用，可以推测HBV可能通过对干扰素效应信号通路中的关键环节进行干预，抑制干扰素诱生的抗病毒基因的表达，从而导致感染慢性化以及对IFN．a的治疗不敏感。为了研究I-IBV与IFN系统间的相互作用，本课题组曾利用cDNA微点阵芯片分析了HepG2细胞和来源于H印G2细胞并整合有HBv基因组的Hep02．2．15细胞经IFN-Ⅱ处理6h前后基因表达谱的差异。结果发现，IFN．n诱导的髓样细胞分化蛋白(MyD88)的基因表达在有HBV复制的HepG2．2．15细胞中明显下降。用抗HBV药物Lamivudine或Adefovir处理HepG2．2．15细

5、胞后，IFN．a诱导MyD88基因的表达出现了显著的上调。这些结果提示了HBv可能抑制IFN．a诱导的MyD88基因的表达。MyD88是介导先天性免疫中Toll样受体(TLRs)信号转导通路的一个关键分子，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，且我们的工作已证实MyD88作为IFN—a诱导的效应蛋白，能够有效的抑$!』HBV的复制。因此，HBV可能通过抑制IFN·a诱导MyD88基因的表达，影响IFN-a介导的抗病毒反应。深入研究HBV抑制IFN-a诱导MyD88表达的机制有可能有助于加深对HBV拮抗干扰素信号通路机制的认识。为此，本研究首先构建TMyDS8启动子报告

6、质粒，用以筛选发挥主要抑制效应的病毒蛋白。将MyD88启动子报告质粒和HBV各蛋白的表达质粒共转Huh7细胞，结果显示HBV多聚酶蛋白可抑制IFN吨诱导的MyD88启动子活性，且抑制硕士毕业论文中文摘要效应表现出剂量依赖的特异性。因此，本研究将进一步的研究重点集中于HBV多聚酶蛋白。将多聚酶蛋白各区段的突变体与MyD88启动子报告质粒共转染细胞，发现末端蛋白(TP)区域在抑制IFN吨诱导的MyD88启动子活性中发挥了比较重要的作用。通过对MyD88启动子区一545一+55bp序列进行生物信息学分析，发现--70至一50bp区域含有Stat和时的结合位点。对MyD8

7、8启动子区进行突变分析发现Stat结合域对于IFN-ct的诱导MyD88启动子活性十分重要。进一步将HBV多聚酶蛋白的表达质粒与突变的MyD88启动子报告质粒共转染细胞发现HBV多聚酶蛋白是一个有效的Stat信号通路抑制因子。在此基础上，本研究探讨了HBV多聚酶蛋白抑制Stat信号通路的可能机制。染色质免疫共沉淀结果显示，多聚酶蛋白可以抑制IFN-a诱导的StatlDNA结合能力。进一步检测Statl701位酪氨酸、727位丝氨酸的磷酸化水平是否发生变化，结果显示Statl的磷酸化激活未受影响。对细胞内Statl蛋白水平的检测显示多聚酶蛋白也不促进Statl的降解

8、。为此本研