干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究

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1、中文摘要干扰素诱导跨膜蛋白抑制痘苗病毒作用及其机制研究干扰素诱导跨膜蛋白（IFITMs）是目前发现的唯一一类阻断病毒进入细胞的宿主限制因子（HRFs），对很多病毒感染均表现出抑制活性，包括囊膜病毒和非囊膜病毒，如IAV、HIV-1及呼肠孤病毒等。然而，IFITMs所抑制病毒几乎都是RNA病毒，还没有发现该类蛋白对DNA病毒抑制作用的详细报道。因此，为了探究IFITMs蛋白在痘病毒感染中扮演的角色，本研究主要围绕该类蛋白和痘苗病毒的相互作用这一主题，综合应用分子生物学、慢病毒包装技术、真核表达技术、免疫荧光技术、荧光显微镜技术、流式细胞仪、实时荧光定量PCR方法、分子荧光标记病毒示踪技术、siR

2、NA沉默技术、免疫沉淀-质谱分析技术、激光共聚焦显微镜技术以及生物信息学等方法，系统分析IFITMs对痘苗病毒感染、复制及进入的影响以及痘苗病毒感染对该类蛋白的表达调控规律，初步探讨IFITMs的作用机制及其可能的相互作用分子。根据本课题组前期研究基础，首先对来源于HEK293T、HeLa和人PBMCs细胞的IFITMs基因与GenBank登陆基因进行同源性分析，发现IFNα处理HEK293T细胞源的IFITM1基因与PBMCs源的基因编码氨基酸序列完全一致；HeLa源的IFITM3蛋白氨基酸序列与其他来源的序列存在1个氨基酸差异（HeLa：R71；其他：C71）；不同源的IFITM2蛋白氨基

3、酸序列存在3个氨基酸差异。而且IFITM2与IFITM3的氨基酸同源性最高、结构相似，IFITM1结构与前两者不同。最终，我们选择人PBMCs细胞来源的IFITMs基因为靶基因，设计引物在N端添加Flag标签序列，然后对其在真核细胞中的表达进行验证，数据显示，IFITMs蛋白在真核细胞内获得表达，为进一步抗病毒研究奠定了基础。进而利用瞬时过表达方法检测IFITMs蛋白对痘苗病毒感染的影响。研究发现，IFITMs过表达对痘苗病毒表现出一定的抑制活性。为了更好地研究IFITMs对痘苗病毒的作用，利用慢病毒表达系统筛选构建了多种稳定表达IFITMs蛋白的细胞系（HEK293T、HeLa、BHK-21

4、、Vero与A549），IFITMs在这些细胞系中无论是mRNA水平还是蛋白水平都获得表达。I而且，分离稳定过表达IFITM3的HEK293T和HeLa细胞的膜蛋白或胞浆蛋白，Westernblot检测发现IFITM3蛋白主要定位在细胞膜上，可能与其作用有关。基于建立的这些细胞系，进行病毒感染试验。通过荧光显微镜、流式细胞仪等分析发现，低感染复数的痘苗病毒在稳定表达IFITMs蛋白的HEK293T、A549、BHK-21或Vero细胞系中的感染明显受到抑制，但在HeLa细胞系中没有发现IFITMs对痘苗病毒感染显著的抑制作用，表明IFITMs抗病毒作用的发挥具有细胞依赖性。实时荧光定量PCR和

5、Westernblot方法对感染不同时间点病毒基因的表达进行分析，发现IFITMs蛋白延缓病毒基因的转录和表达，由于前期发现该类蛋白对病毒基因的表达没有直接影响，因此认为IFITMs通过抑制病毒的增殖延缓了病毒基因的转录和表达。在IFITM3稳定表达的BHK-21细胞系中病毒生长曲线显示，IFITM3抑制病毒的增殖。噬斑分析实验表明，IFITM3抑制病毒在细胞间的传播和扩散，抑制病毒的复制。此外，实验中还发现IFITMs蛋白抑制鸡痘病毒感染BHK-21细胞。为了进一步探讨内源性IFITMs在细胞固有抗病毒反应和IFN介导的抗病毒反应中的作用，设计了靶向干扰IFITMs的siRNAs，在IFIT

6、M蛋白组成性高表达的A549和HeLa细胞中进行了siRNA干扰实验，显示内源性IFITMs蛋白敲低后没有表现出感染显著增强现象，但减弱了IFN介导的抗痘苗病毒作用，而且表现出细胞类型差异。另外，在过表达IFITM3的293T细胞系中的siRNA干扰实验显示，IFITM3沉默后增强病毒感染。此外还分析了siRNA处理及处理后病毒感染时的细胞活性，发现IFITMs基因沉默对细胞的活力没有显著影响，但在病毒感染时维持细胞活性发挥一定的作用。在以上研究的基础上，以IFITM3为主要研究对象，对其在抑制病毒感染的作用阶段及机制进行了初步探索。研究发现，IFITM3抑制病毒早晚期基因转录起始，表明IFI

7、TM3作用于病毒早期基因转录起始之前的病毒颗粒的进入阶段。进而，利用激光共聚焦显微镜和分子荧光标记病毒技术分析了IFITM3对病毒-细胞结合的影响，研究发现IFITM3干扰病毒-细胞吸附过程。同时，利用激光共聚焦显微镜观察病毒进入过程，综合以上数据发现IFITM3在病毒进入阶段已经发挥抑制作用。此外，在过表达IFITM3的BHK-21细胞系中对IFITM3进行了定位分析，结果发现IFITM3在细胞