七种病原体lamp快速检测研究

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1、ofconventionalPCRassay,thedetectionlimitofLAMPassayforT.gondii,EHECO157:H7,S.dysenteriae,V.cholera,V.parahaemolyticus,RotavirusG3andNorovirusGIIwas1pg/µL,10cfu/mL,12cfu/mL,20cfu/mL,15cfu/mL,15.6pg/tubeand25pg/tube,respectively.Conclusion:Asaconsequence,weestablishedsevenspecific,sen

2、sitiveandrapidLAMPorRT-LAMPdetectionmethodforT.gondii,EHECO157:H7,S.dysenteriae,V.cholera,V.parahaemolyticus,RVG3andNorovirusGII,respectively.Postgraduate:ZHANGRu-sheng(MajoringinPathogenicBiology)Directedby:ProfessorYangQiu-linKeywords:LAMP;RT-LAMP;detection;pathogen4七种病原体LAMP快速检测研

3、究前言弓形虫、肠出血型大肠杆菌O157:H7、痢疾志贺菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、轮状病毒及Norwalk病毒七种病原体广泛分布于自然界，污染食物、水源，造成人体感染，传统的显微镜检查、分离培养等检测方法尚难完全满足现在的需要。近年来，[1]采用的免疫学方法其特异性有待提高。以检测核酸为目的的PCR需要PCR仪等设备，基层普及应用困难。因此，建立上述七种病原体特异、快速及能用于现场的检测方法具有一定的意义。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification.LAMP)技术是Notomi等[2]于2000年报道的一种新型等温

4、核酸扩增方法，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNA聚合酶），在恒温条件(65℃左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，扩增出特征性LAMP梯[3]形条带，反应速度还可通过设计两条环引物使其增加1/2-1/3。LAMP的特点有：①特异性强。4条引物对靶序列的6个特异序列区的识别，保证了LAMP扩增的高度特异性，几乎不会产生非特异性扩增。②敏感性高。与PCR相比，其检测限更低，仅[2]为5个拷贝。③等温高效。LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间910[3]的损失，在1h内可将靶序列扩增至1

5、0~10倍，且不需要模板的热变性。④操作[2]简便。反应不需PCR仪和特殊试剂；LAMP反应能产生大量的副产物-焦磷酸镁离子，在反应管中形成白色混浊，结果可通过肉眼或浊度计对扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判定；也可用结合双链DNA的荧光染料SYBRGreenI染色，在紫外灯下或日光下通过肉眼进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持[4][5]SYBRGreenI的橙色不变。⑤通过逆转录酶，LAMP可直接扩增RNA。目前[4,6,7,8,9]LAMP技术已有成功用于多种病原体检测的报道。本研究利用LAMP技术建立了针对上述七种病原体相应的LAM

6、P或RT-LAMP检测方法，为疾病诊断、食品卫生监测等提供快速、有效的检测方法。5第一章弓形虫LAMP快速检测研究弓形虫(T.gondii)可通过母婴垂直传播，造成胎儿畸形、神经系统发育障碍及引起死产或流产等。目前，弓形虫感染的检测方法主要靠病原学检查和免疫学方法[10,11,12]，但病原学检查检出率低，免疫学方法不能早期诊断且特异性有待提高，以检测病原体核酸为目的的LAMP法可以弥补上述缺点。材料与方法1材料1.1虫种弓形虫RH株、卡氏肺孢子虫、血吸虫由本室保存，间日疟原虫、恶性疟原虫由福建省疾病控制中心张山鹰研究员惠赠。1.2试剂AgaroseRegul

7、ar（大连宝生物），AMV反转录酶、SYBRGreenI（invitrogen），Betaineanhydrous（Fluka），BstDNAPolymerase（NEB），DNAmarker、dNTP、基因组DNA提取试剂盒（北京天根），Magnesiumsulfate(Sigma)，QIAampViralRNAMiniKit(QIAGEN)，限制性内切酶（Fermentas），TaqplusDNA聚合酶（北京鼎国公司）。2方法2.1引物选取弓形虫B1基因（登录号：AF179871）的987bp~1198bp区域，通过PrimerExplorerV3设计LA

8、MP引物（表1），由广州英骏公司合成。