小鼠胚胎干细胞在丝素材料上向神经细胞分化的研究

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１２）：７２～７６殏檪檪檪檪檪檪檪檪殏檪檪简报檪檪殏檪檪檪檪檪檪檪檪殏小鼠胚胎干细胞在丝素材料上向神经细胞分化的研究鲍柳君叶荣韩甫张军超张焕相（苏州大学医学部基础医学与生物科学学院江苏省干细胞研究重点实验室苏州２１５１２３）摘要以小鼠胚胎干细胞（ＥＳ）为种子细胞，使用改良的４／４＋ＲＡ方案，诱导小鼠ＥＳ细胞在丝素材料上向神经细胞分化，探讨丝素材料对其生长、黏附、分化等情况的影响。将小鼠ＥＳ细胞悬浮培养４ｄ得到的拟胚体（ＥＢｓ）分别接种到经丝素膜和明胶包被的培养皿上进行诱导，比较不同

2、材料上ＥＢｓ的贴壁率及向神经元分化的比率。结果表明ＥＢｓ在明胶和柞蚕丝素蛋白膜（ＴＳＦ）上贴壁较快，平均贴壁率为９０．３％和８４．４％，在桑蚕丝素蛋白膜（ＳＦ）上贴壁较慢，贴壁率低，仅为３８．５％，同时三者神经元的分化比率均能达到４０％以上，无明显差异。以上实验显示ＴＳＦ有望成为小鼠ＥＳ细胞向神经细胞分化的支架材料。关键词胚胎干细胞丝素神经细胞中图分类号Ｑ８１９神经系统疾病严重危害着人类的健康，除了常规性材料，有着很多优异的条件：可被加工成各种形态，药物治疗之外，细胞替代性治疗已经成为生物医学研如丝素膜、丝素纤维、水凝胶、多孔海绵等；有良好的生［１］究的热点

3、。所谓细胞替代性治疗，即用体外培养所物相容性，无毒，无刺激性；在体内会被缓慢吸收降解；获得的细胞进行移植，从而替代患者体内已经丧失功可进行特定基团修饰、改性，还有望负载与干细胞增［２］能的细胞，以达到缓解症状甚至治愈疾病的目的。殖、分化有关的特定因子或诱导剂。用于移植的神经细胞的来源是神经退行性疾病细胞替本实验以小鼠ＥＳ细胞为种子细胞，使用改良的代性治疗研究的一个重点，理想的供体细胞应该能够４／４＋ＲＡ诱导方案，将ＥＳ细胞直接在丝素材料上向进行大量扩增，具有特定的生物学功能，进入体内后能神经细胞分化，探讨丝素材料对其生长、黏附、分化等够发挥相应的生理作用［

4、３，４］。胚胎干细胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ情况的影响，可为将来ＥＳ细胞与具有３Ｄ结构并经过ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＥＳｃｅｌｌｓ）自我更新的特点，使其能在体外保修饰、改性及负载诱导剂的丝素材料结合，控制其分化持未分化的状态进行长时间的培养，从而获得大量的为特定的神经细胞，最终用于神经系统退行性疾病的细胞，而且在一定条件下，ＥＳ细胞可向多方向或单方向临床治疗提供实验依据。诱导分化。因此，ＥＳ细胞向神经方向诱导分化使其有１材料与方法望成为神经移植的一种无限的细胞来源。丝素蛋白材料作为临床修复和组织工程支架及改１．１材料ＤＭＥＭ（高糖）培养液、胎牛血清（ＦＢＳ）、新生小

5、牛收稿日期：２００８０７０８修回日期：２００８０８２７国家自然科学基金（３０６７１０４１）、国家“９７３”计划血清（ＮＣＳ）和非必需氨基酸（ＮＥＡＡ）购自Ｇｉｂｃｏ公司，（２００５ＣＢ６２３９０６）、江苏省高校自然科学重大基础研究项目胰蛋白酶（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、β巯基乙醇、丙酮酸钠、维甲酸（０６ＫＪＡ１８０２５）资助项目通讯作者，电子信箱：ｈｚｈａｎｇ＠ｓｕｄａ．ｅｄｕ．ｃｎ（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｓ，ＲＡ）购自Ｓｉｇｍａ公司，Ｌ谷氨酰胺及明２００８，２８（１２）鲍柳君等：小鼠胚胎干细胞在丝素材料上向神经细胞分化的研究７３胶购自上海生工，

6、人类白细胞抑制因子（ｈＬＩＦ）为１．５ＥＢｓ接种到丝素膜材料诱导成神经样细胞βⅢＣｈｅｍｉｃｏｎ产品，丝裂霉素Ｃ购自Ｒｏｃｈｅ公司。细胞培Ｔｕｂｕｌｉｎ阳性细胞比率的比较养皿购自Ｃｏｒｎｉｎｇ公司。小鼠ＥＳＳ８细胞株，由上海交对上述诱导培养４～５ｄ的ＥＢｓ用０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ５２通大学附属新华医院发育生物学研究中心提供。桑蚕０．０２％ＥＤＴＡ消化，离心收集细胞，以３×１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ丝素蛋白膜（ＳＦ）和柞蚕丝素蛋白膜（ＴＳＦ）由苏州大分别接种到不同材料包被的培养皿中，培养３６ｈ，待细学材料工程学院自行研制和提供。胞充分贴壁铺展后，固定染色，

7、方法同上。细胞核用１．２小鼠ＥＳ细胞培养Ｈ３３２５８室温５ｍｉｎ。统计分析各自βⅢＴｕｂｕｌｉｎ阳性５２小鼠ＥＳＳ８细胞培养于经丝裂霉素Ｃ处理的由小细胞比率。同时离心收集的细胞以３×１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ相鼠胚胎成纤维细胞（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＥＦｓ）同密度接种到各自包被的培养皿，处理同上，统计直接制备的饲养层上，培养基为含１５％ＦＢＳ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ贴附于培养皿上的非神经细胞数（细胞总数减去βⅢβ巯基乙醇、２ｍｍｏｌ／ＬＬ谷氨酰胺、０．１ｍｍｏｌ／ＬＮＥＡＡ、Ｔｕｂｕｌｉｎ阳性细胞数）。０．１ｍｍｏｌ／ｌ丙

8、酮酸钠、ｈＬＩＦ１０ｎｇ／ｍｌ的高糖ＤＭＥＭ培１．７