胚胎干细胞分化神经细胞特性及分化机制的研究

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1、浙江大学硕：b论文摘要干细胞研究在人类生命科学中具有重要的基础研究意义，在人类健康和生命质量领域具有广泛的应用前景。胚胎干细胞来源于受精卵发育早期胚胎的内细胞团，具有发育的全能性，可以分化为体内所有类型的成熟细胞。在发育生物学、细胞治疗、组织器官工程等研究和开发中具有巨大的潜力。为了全面认识Es细胞的特性并为今后进行转基因动物、组织工程研究做好铺热，我们进行了小鼠ES细胞的建系研究，以ICR种和昆明种小鼠为实验对象，采用超数排卵的方法获得孕3，5d小鼠囊胚，培养在用丝裂霉素C处理过的MEF细胞饲养层上，选取适当时间离散增殖的ICM和类ES细胞集

2、落，分析了在小鼠Es细胞建系过程中，饲养层细胞、消化液及不同品系来源的胚胎的影响。结果，ICR小鼠和昆明小鼠两种来源的饲养层细胞对胚胎贴壁、ICM增殖无影响：消化液浓度和作用时间对ICM的影响明显，以较低浓度的胰酶和EDTA消化为宣；另外，血清质量、培养板质量等因素可能影响建系。为了探讨小鼠胚胎干细胞分化神经细胞的功能特性，及其分化过程中N．甲基．D．天冬氨酸(N—methyl．D．aspartate，NMDA)受体的袭达情况，我们利用全反式维甲酸(RA)诱导胚胎干细胞拟胚体定向分化为神经细胞，用摄像相差显微镜观察分化神经细胞的形态，用免疫细胞

3、化学方法鉴定分化神经细胞表达特异性抗原，用逆转录一聚合酶键反应(RT-PCR)检测分化神经细胞CalbindinD28K和NMDA受体(NR)亚型mRNA的表达情况，用荧光共聚焦显微镜检测分化神经细胞在NMDA刺激下胞内游离ca2+浓度的变化。结果显示，lX10西mol／LRA的培养基诱导培养ES细胞拟胚体4天，在拟胚体周围出现大量神经样细胞，分化神经细胞的比率与拟胚体的大小有关；撤除RA继续培养4d后可以检测到NR2BmRNA的转录，NR2C有弱的转录；在第6d后NR2A有转录；在第8d及其之后NRl的转录出现。撤除RA继续培养8天后在拟胚体

4、周围出现大量神经样细胞；RT-PCR检测显示有CalbindinD28和NRl、NR2A、NR2B、NR2CmRNA的转录：在NMDA刺激下胞内游离ca2+浓度明显升高(P

5、干细胞分化神经细胞的机制，我们研究了与干细胞自我更新、增殖与分化有关的信号转导机制方面的科研文献，对干细胞信号转导研究的最新进展作了综述。胚胎干细胞通过LIF／STAT信号通路、BMP／Smad／Id信号通路等维持自我更新，这两条信号通路维持了Oct4和Nanog基因的表达，Oct4和Nanog是两个维持ES细胞不分化并保持自我更新的关键基因。而RA通过激活核受体RAR、RXR来抑制ES细胞Oct4基因的表达，同时，RA导致wm表达增加、Wnt信号通路增强，从而导致ES细胞向神经细胞分化。但是，人们对于哺乳动物细胞增殖和分化的信号通路的认识，还

6、处于数据收集和初步整理阶段，尚需要更多研究才能彻底认识细胞增殖和分化的机制。关键词：胚胎干细胞体外培养定向诱导分化神经前体细胞神经细胞NMDA受体功能特性分化机制浙江大学硕士论文ABSTRACTEmbryonicstem(ES)cellsorepluripotentcelllinesestablishedfromundifferentiatedembryoniccellscharacterizedbynearlyunlimitedself-renewalanddifferentiationcapacity．Duringdifferentiati

7、oninvitro，EScellswerefoundtobeabletOdevelopintospecializedsomaticcellstypesandtorecapitulateprocessesofearlyembryonicdevelopment．ThesepropertiesallowtouseEScellsasmodelsystemforstudyingearlyembryonicdevelopmentbygain-orloss—of-functionapproaches，ortoinvestigatetheeffectsofdr

8、ugsandenvironmentalfactorsondifferentiationandceilfunctioninembryotoxicitya