prrsv+nvdcjxa1株膜基质蛋白单克隆抗体的研制及冰冻切片免疫荧光技术快速检测prrsv抗原

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1、新疆农业大学硕士学位论文PRRSVNVDC-JXA1株膜基质蛋白单克隆抗体的研制及冰冻切片免疫荧光技术快速检测PRRSV抗原姓名：王元申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：冉多良20090601PRRSVNVDC—JXAl株膜基质蛋白单克隆抗体的研制及冰冻切片免疫荧光技术快速检测PRRSV抗原摘要猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。近几年来我国大部分地区夏秋季出现猪的高热病，我国农业部2007年确定引起高热病的主要病原是猪繁殖与呼

2、吸综合征病毒变异株。目前，该病已是危害我国养猪业最严重的病毒性疫病之一。本研究将纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)NVDC-JXAl株免疫6,--,8周龄BALB／C小鼠。应用淋巴细胞杂交瘤技术，最后一次免疫后第三天取其脾细胞与SP2／0细胞在聚乙二醇作用下融合，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)筛选，得到2株稳定分泌抗PRRSVNVDC-JXAl株特异性抗体的杂交瘤细胞，命名为1D12、5H5。经鉴定其抗体亚型分别为lgG2b、IgM，两株均为1c链，细胞上清ELISA效价1

3、：103----,1：104腹水ELISA效价可达1：105"--'1：107两株单克隆抗体与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪乙脑病毒无交叉反应，与PRRSVVR．2332株有交叉反应。免疫印迹(Western．blot)结果显示，该两株单抗是针对PRRSVNVDC．JXAl膜基质蛋白的特异性McAb。利用前期获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体1D12作为一抗，建立了在冰冻切片中快速检测PRRSV抗原的免疫荧光(IFA)方法。运用该方法检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪

4、圆环病毒、猪乙脑病毒感染发病猪组织无特异性免疫荧光信号，而检测PRRSVNVDC-JXAl株人工感染28日龄仔猪，在人工接种后14d即可在肺脏、NI'-J淋巴结、脾脏、扁桃体、肾脏、大脑等组织脏器中检测到特异性免疫荧光信号；检测临床可疑病例的PRRSV的阳性率(62．5％)比病毒分离率(31．25％)高，并且符合率达100％。结果表明，该方法具有快速、敏感、特异、直观的特点，可用于PRRSV感染的实验室快速诊断。关键词：PRRSV，膜基质蛋白，单克隆抗体，免疫荧光试验，冰冻切片Developmentofmonoc

5、lonalantibodiesagainstmatrixproteinofPRRSVNVDC—JXAlstrainandantigensofPRRSVquicklydetectedinfrozehistologicalsectionbyanimmunofluorescenceassayAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)wasthecausativeagentofPRRS，whichcausedreproductivefailu

6、reinSOWSandrespiratoryproblemsinpiglets．．Inrecent，somepigfarmsinChinaoccurredswinehighfeverinsummer．In2007，ChineseAgricultureDepartmentannouncethatPRRSVwasthemainangeninhighfever．Atpresent，Ithasbeenoneofmostseriousvirulentepidemicdiseaseswhich．harmourcountryp

7、ig-breedingindustry．Inthisstudy,6-8week—oldBALB／cmicewereimmunizedconventionallywiththepurifiedvirionsofPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)NVDC·JXAlstrain．Byusingthehybridomatechnique，Onthethirddayafterthefinalimmunization，spleencellsofmicef

8、usedwithmyelomacellsSP2／0werefilteredbyculturingselectively,Thetwomonodonalantibodies(McAbs)wereobtainedbyEnzyme—linkedImmunosorbentAssay(EUSA)testandIndirectimmunofluorescentAssay(IFA)an