mirna-410对小鼠视网膜新生血管抑制作用的研究

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1、第二军医大学博士学位论文miRNA--410对小鼠视网膜新生血管抑制作用的研究姓名：陈娜申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：柳林；刘善荣201205miRNA-410对小鼠视网膜新生血管抑制作用的研究摘要视网膜新生血管性疾病，如糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞和早产儿视网膜病变等均会导致视网膜新生血管化。目前视网膜新生血管性疾病，是世界范围内最严重的致盲性眼病之一，在发达国家已上升为致盲性眼病的首要原因。随着我国人民生活水平提高，眼底新生血管性疾病也日渐成为威胁我国人民视力健康的重要原因。视网膜新生血管的形成可引起玻璃体出血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼，其发病

2、机制并未完全清楚。但近年来生长因子在视网膜新生血管形成中的作用已形成共识。局部组织新生血管刺激因子和抑制因子动态平衡的失调是产生新生血管的关键。已发现的刺激血管生长的因子包括：血管内皮生长因子(vaScularendotIlelialgro叭hf．actor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(助roblastgrowcllf．actor，FGF)、白细胞介素8(iIlterlukin．8)等。已发现的抑制血管生长的因子有转化生长因子(tmsf．onI】liIlggrowchf．actorbeta，TGF．B)和血栓素(thrombospondin)等。VEGF是视网膜新生血管

3、形成最主要的生长因子。虽然视网膜新生血管形成的机制尚未完全明了，许多调节因素也仍然不清，但是许多研究表明，抑制VEGF的表达，可以减少视网膜新生血管的形成。microRNA(miI矾A)是一种长度约22nt的内源性，非编码单链小分子RNA，与靶基因mRNA的3’非翻译区进行碱基互补配对后，发挥对n删A的降解作用或抑制mI酬A的翻译，从而对基因进行转录后表达的调控。大约30％的蛋白质编码基因是由mil冰A调控的。miRNA在细胞的增殖，分化和凋亡以及所报道的所有生物学进程中都发挥重要的作用。microRNA已经在肿瘤、心血管等方面研究取得了一定的进展，其在眼科的应用也引起了学

4、者们的兴趣，有研究发现在视网膜和眼部其他组织中，microRNA的表达具有组织特异性和发育阶段特异性，提示其在视网膜和眼部其他组织中具有潜在的组织和细胞的功能特异性。本实验通过构建小鼠microIⅢA-410质粒载体，以高氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型为实验对象，将构建好的浓缩质粒通过以下两种不同的方式：1．玻璃体腔注射浓缩质粒入小鼠眼球，5天后取材观察疗效。2．将浓缩质粒制成眼药水，每天对实验动物局部点眼药水观察治疗效果，持续5天。最后研究结果表明microI斟A．4lO可通过下调VEGF的表达抑制血管内皮细胞的增殖，减少视网膜新生血管数量，从而阻碍新生血管的形成。第二军

5、医大学博士学位论文第一部分mil州A．410质粒载体的构建及验证目的构建miRNA-410质粒载体，并在细胞水平验证其对vEGF的抑制作用方法构建miIⅢA-410重组表达质粒(pLKo．1．miI斟A．410)；采用脂质体法分别将表达质粒和空质粒转入人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。转染后采用I汀．PCR法检测转染后重组质粒的表达情况；实时定量PCR及weStemblot检测VEGF表达的改变。结果成功构建了mi砌妊-410重组质粒。转染了pLKo．1．miI矾A．4lo的HUVEC中VEGF表达较转染pLKO．1-mock中的表达明显下调p

6、I醐A-4lO．锄tiSeIlse的HUvEC中VEGF表达较转染pLKO．1．mock中的表达明显上调p<口卿。结论成功构建了miRNA_4lo重组质粒，并在细胞水平验证其对vEGF的抑制作用。第二部分可定量的氧诱导小鼠视网膜新生血管模型的建立及ⅦGFmRNA的动态表达目的建立可对视网膜新生血管进行定量研究的动物模型，为下一步研究视网膜新生血管发生机制及治疗提供实验基础。方法选择健康7日龄(P7)c57BL／6J小鼠，雌雄不限。共16窝loo只，随机分为高氧组(O瓜组)和对照组(C组)。高氧组：将50只7日龄的C57BL／6J小鼠(P7)连同母鼠放在浓度为(75±2)％的

7、氧浓度环境中，5天后回到正常空气中，作为氧诱导模型组；对照组：另50只同日龄新生小鼠置于正常空气环境中生活，作为正常对照组。两组小鼠分别在P13、P15、P17、P19、P23分批处死，摘除眼球，通过FITC．DeX臼加荧光造影视网膜铺片观察视网膜新生血管形态变化；组织切片观察并计数矢状面5咖视网膜切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数，反映视网膜血管的增生情况；real．timeRT．PCR检测视网膜中VEGFmRNA的动态表达。miRNA．4lO对小鼠视网膜新生血管抑制作用的研究结果荧光素血管灌注法视网膜铺片结果：