phd2对结肠癌细胞糖酵解活性的调控作用及分子机制研究

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1、第三军医大学博士学位论文PHD2对结肠癌细胞糖酵解活性的调控作用及分子机制研究姓名：谢赣丰申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：梁后杰201205第三军医大学博士学位论文PHD2对结肠癌细胞糖酵解活性的调控作用及分子机制研究摘要一、背景正常细胞向恶性细胞的转化过程中伴随着代谢途径的重塑，其中最典型的是肿瘤细胞即便在氧气供应充足的情况下也主要以糖酵解而非氧化磷酸化提供能量，这种糖代谢途径的重塑被称为有氧糖酵解或Warburg效应。该表型可促使肿瘤细胞产生凋亡耐受、生物合成前体分子生成增加以及侵袭能力增强。肿瘤细

2、胞能量代谢的适应性改变也是导致肿瘤对放化疗耐受的重要原因。目前，肿瘤糖代谢重塑的分子基础和确切机制尚未完全阐明。实体肿瘤在不断生长的过程中，其中心会形成缺氧环境。肿瘤细胞为应对缺氧的压力，遂启动异常活跃的糖酵解，同时启动促血管机制以增加肿瘤血管形成，从而使自身得以存活和生长。在这一过程中，感受瘤体内氧分压的改变并及时启动肿瘤糖酵解是其中的关键环节。我们推测，作为细胞内最重要的氧感受器，脯氨酸羟化酶(prolylhydroxylases，PHDs)可能是上述关键环节的关键分子。现已证实在哺乳动物细胞中有三种类似的

3、酶——PHDl、PHD2和PHD3，它们都含有O【、D两个亚基，其中0【亚基有脯氨酸羟化酶的活性。常氧时，PHD可将缺氧诱导因子(hypoxia—induciblefactor，HIF)．10【的两个脯氨酸残基羟基化，介导其被蛋白酶体降解。现已证实，PHD2是HIF一1仅最重要的调控因子。此外研究发现，PHD2在多种肿瘤细胞系或肿瘤组织中表达缺失，提示其可能具有抑癌作用。目前已发现PHD2与肿瘤血管生成密切相关，且已证实肿瘤细胞能量代谢的改变早于肿瘤血管生成，那么PHD2是否在肿瘤糖酵解代谢方面发挥作用，目前还

4、有待研究。本研究拟采用基因干扰重建、免疫共沉淀等现代分子生物学技术，以结肠癌细胞为研究对象，首先通过干扰或重建PHD2表达，观察肿瘤细胞在葡萄糖摄取、乳酸及能量分子生成等方面的相应变化，以明确PHD2对肿瘤糖酵解代谢的调控作用；进而研究主要能量相关通路在PHD2上述调控作用的活化情况，以期进一步阐明PHD2调控肿瘤糖酵解的分子机制。本研究不仅有助于加深对肿瘤糖酵解代谢机制的认识，而且能为针对肿瘤糖酵解的有效靶向治疗提供新策略。第三军医大学博士学位论文二、目的明确PHD2对肿瘤糖酵解代谢的调控作用，进一步阐明PH

5、D2调控肿瘤糖酵解的分子机制。三、材料与方法1．采用免疫组化、Westernblot及定量PCR的方法检测人结肠癌组织及细胞PHD2及糖酵解相关蛋白的表达，并分析其相关性。运用KaplanMeier生存曲线及多因素Cox模型分析PHD2在判断结直肠癌患者预后的临床价值。2．采用RNA干扰、特异性抑制剂和基因过表达的方法，抑制结肠癌LSl74T细胞PHD2及上调SW480细胞的PHD2，利用Westernblot检测PHD2及糖酵解相关蛋白HK2、PDKl和Glutl的表达，采用液闪测量、酶标法、高效液相层析检测

6、上述PHD2抑制或表达重建细胞的葡萄糖摄取量、乳酸生成量及ATP／ADP比值。利用Mitotracker检测细胞的线粒体数量。3．采用液闪测量、酶标法、高效液相层析检测PHD2和HIF—ls双干扰LSl74T细胞的葡萄糖摄取量、乳酸生成量及ATP／ADP比值。利用Westernblot和ELISA检测抑制PHD2表达的LSl74T细胞的LKBl／AMPK及IKK／NF—r．B通路蛋白的活化情况。利用信号通路抑制剂结合液闪测量、酶标法、高效液相层析检测NF一心通路抑制剂对PHD2抑制的LSl74细胞糖酵解效应。利

7、用免疫共沉淀判断NF一1出信号通路蛋白与PHD2的相互作用。四、结果1．PHD2在结直肠癌组织中的表达显著低于正常结肠组织。所检测结肠癌肿瘤细胞仅LSl74有稍高水平的PHD2表达，而其它细胞系均维持较低水平。结直肠癌组织中HK2、PDKl、GlutlmRNA表达水平与配对癌旁组织之间差异均有统计学意义。KaplanMeier生存分析表明PHD2低表达的早期结直肠癌患者预后显著差于高表达患者。多因素Cox模型分析发现，PHD2在结直肠癌患者中是一个独立的预后因素。2．DMOG对结肠癌细胞LS174T细胞PHD2

8、蛋白表达的抑制呈浓度依赖。利用DMOG处理LSl74T细胞后可促进糖酵解。采用PHD2干扰质粒转染LSl74T细胞后，其葡萄糖摄取量、乳酸产量以及ATP／ADP比值均显著增加。用PHD2过表达载体转染SW480细胞，Westernblot检测发现过表达PHD2的SW480细胞的糖酵解相关分子包括Glutl、HK2、PDKl的表达均显著被抑制，其葡萄糖摄取量、乳酸产量以及ATP／ADP比