hsp90α在食管鳞癌组织及细胞中的表达及17-aag对食管鳞癌细胞株的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文HSP90α在食管鳞癌组织及细胞中的表达及17--AAG对食管鳞癌细胞株的影响姓名：宋雪冰申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：曹富民201203中文摘要HSP90a在食管鳞癌组织及细胞中的表达及17．AAG对食管鳞癌细胞株的影响摘要目的：热休克蛋白90(heatshockprotein90，HSP90)是一组在真核和原核细胞中都普遍存的高度保守的分子伴侣，由基因编码不同的Hsp90a和Hsp90p两个亚型组成。HSP90己被证实在多种恶性肿瘤中高度表达，但是多肿瘤细胞中Hsp90a呈高表达而H

2、sp90p的表达却基本不变，提示HSP90a与肿瘤细胞的关系更加密切，而且代表了恶性肿瘤的潜在治疗靶点。17．AAG作为HSP90的抑制剂，可以通过占据HSP90的ATP结合位点干预HSP90与客户蛋白的结合，诱导HSP90与其客户蛋白的分离和降解，在体外培养的多种恶性肿瘤细胞中均表现出抗肿瘤的活性，目前已进入临床III期试验阶段。然而有关17．AAG对食管鳞癌细胞株和HSP90a表达的影响的文献报道不多。HIF．1是一种受氧水平调控的转录因子，作为一种转录激活剂，HIF．1主要通过肿瘤细胞对缺氧的适应和血管再生等方面的

3、作用促进肿瘤的生长和转移。HIF．1a作为HIF．1的亚型，在前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌等多种常见恶性肿瘤及其转移灶中过度表达。近期包括TakalaH在内的多项研究表明，HIF—la在食管鳞癌中的表达也呈现高表达。在之前的研究中，转录因子HIF．1a已被证实为HSP90的客户蛋白，在维持HIF．1a活性方面HSP90发挥重大作用。最新的研究表明，GA、17．AAG可以诱导前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤细胞中HIF．1a的降解，抑制肿瘤的侵袭和转移。而有关17．AAG对食管鳞癌细胞中HIF．10【表达影响的研究未发现。本研究

4、分别应用免疫染色测定HSP90a在食管鳞癌组织及细胞中的表达；MTT法和流式细胞术检测17．AAG对食管鳞癌细胞株增殖及凋亡的影响；IUPCR和Wrestem分析17．AAG对HIF．1a在基因水平和蛋白水平的影响极其相关性。方法：l食管鳞癌组织HSP90a的表达及临床意义。40例包括癌组织、癌旁和正常组织的标本均取自河北医科大学第四中文摘要医院胸外科住院的食管癌患者。全部病例术前均未行放、化疗，且癌组织经病理学证实均为食管鳞状细胞癌，癌旁及正常组织均经HE染色证实未被癌细胞浸润。采用免疫组织化学SP法检测标本中癌组织、

5、癌旁组织、正常粘膜组织的HSP90a的表达。并利用统计软件SPSSl3．0进行统计学分析，探讨HSP90a在癌组织、癌旁组织、正常粘膜组织的表达有无差异性，并且其与肿瘤长度、肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期的关系。2细胞培养：用于实验的食管鳞癌细胞株TE．1、TE．13和Yes．2均由河北医科大学第四医院科研中心提供，细胞株以含10％胎牛血清的RPMll640完全培养基置于37℃、饱和湿度、5％C02培养箱中常规传代培养。3人食管鳞癌细胞TE．1、TE．13和Yes．2中HSP90a的表达：随机选取对数期生长的

6、食管鳞癌细胞TE．1、TE．13和Yes一2，细胞重悬后调整细胞密度为5×105／ml，使其在放入盖玻片的6孔板生长，37。C、5％C02培养48小时后终止培养，用4％多聚甲醛固定后制成细胞爬片，以PBS代替一抗的细胞染色作为阴性对照，进行SP法免疫细胞染色观察食管鳞癌细胞中HSP90a的表达。417一AAG对人食管鳞癌细胞株TE．1、TE．13和Yes．2增殖的影响：应用MTT法，以不同浓度组的17．AAG分别处理TE．1、TE．13和Yes．2细胞24h、48和72h后，以不含17．AAG的细胞为空白对照，分别应用酶

7、标仪检测细胞在波长为492nm处的吸光度值，以波长为570nm处测得的值为参考，计算细胞的存活率，从而反映17．AAG对这三种鳞癌细胞株增殖的影响。517．AAG对人食管鳞癌细胞株TE．1和TE．13凋亡的影响：以不加17．AAG的细胞作为空白对照组，采用ArulexinV-FITC／PI双染的流式细胞学方法定量分析经不同浓度的17．AAG作用于食管鳞癌细胞TE一1和TE．1348小时后细胞的凋亡率。617．AAG对HSP90et及其客户蛋白HIF．1et的影响：分别采用半定量RT-PCR和Westernblot方法，检

8、测并比较了经不同终浓度组处理的TE．1和TE．13细胞中HSP90a和其客户蛋白HIF．et在mRNA和蛋白水平的表达。探讨17．AAG对HSP90a及其客户蛋白HIF．1a中文摘要在两种水平表达的影响及基因和蛋白水平的表达是否具有一致性。结果：l食管鳞癌组织、癌旁组织及正常食管粘膜中HSP90a的阳性表达率分别为8