γδt细胞抗结核菌感染机制的研究

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1、硕士学位论文学校代码：10023学号：$2008219俩T细胞抗结核菌感染机制的研究所院姓名导师寸y⋯导师小组学科专业研究方向完成日期北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所庞永胜何维教授崔莲仙教授、马驰研究员免疫学感染免疫2012年5月北京协和医学院硕十研究生论文目录目录lIIIIIITlllllIllllllllIIIIMI[IIlY2123479中文摘要⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．1Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．．3英文缩略词表⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．5前言⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第一部分：结核菌H37Rv株重组蛋白Rvl194c的原核表达、鉴定及对人y6T细胞作用的初步研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12材料⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12方法⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．16结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28讨论⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39第二部分：Multl和MultlS转基因小鼠的传代和鉴定⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯40材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、．．4l结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．．48第三部分：AyST细胞永生化研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．49方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．．57讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯62全文结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．65文献综述⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．68个人

4、简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯78致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯80独创性声明⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．81北京协和医学院硕十研究生论文文摘要俩T细胞抗结核菌感染机制的研究中文摘要结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，由T淋巴细胞介导的细胞免疫对结核病的发病、演变及转归有决定性影响。78T细胞作为连接天然免疫和适应性免疫的T淋巴细胞，在抗结核菌感染中发挥重要作用。78T细胞表面的78T受体(78TCellReceptor,y6TCR)和自然杀伤细胞活化型受体2D(Naturalkillergroup2m

5、emberD，NKG2D)介导78T细胞的抗感染过程。作为这些受体的配体，结核菌的蛋白抗原和被结核菌感染的细胞表面应激分子激活了78T细胞的抗结核免疫反应。但是，v6T细胞通过78TCR识别结核菌抗原，并通过NKG2D识别被结核菌感染细胞上的ULl6结合蛋白(ULl6bindingprotein，ULBP)分子，从而将天然免疫和适应性免疫连接起来抵抗结核菌感染的机制尚未完全澄清。本实验室前期的研究结果表明，yST细胞很可能通过78TCR的互补决定区3(Complementarydeterminingregion3，CDR3)识别结核菌蛋白Rvll94c，所

6、以，我们对该蛋白进行原核重组表达，来研究78T细胞通过78TCR识别结核菌抗原的机制。同时，我们建立了鼠类ULBP样转录本1(MurineULBP．1iketranscript1，MULTI)转基因小鼠，拟通过过量表达ULBP的类似物MULTl，来研究yST细胞识别ULBP的机制。考虑到结核菌以慢性感染为主的特点和78T细胞在体外不能长期存活的局限，我们决定对yST细胞进行永生化培养，以期得到生长期限延长的yST细胞，而便于在体外研究机体在抗结核菌慢性感染的过程中78T细胞所起的长期作用。本文有三部分研究内容：结核菌重组蛋白的原核表达和鉴定，两个品系转基因

7、小鼠的传代和鉴定，人78T细胞的永生化。本文的科学意义在于：获得了对人yST细胞有扩增作用的结核菌蛋白、获得了稳定传代的阳性转基因小鼠和生长时限延长至50天的人yST细胞，从而为后续研究人yST细胞抗结核菌感染的机制打下了基础。为阐H凋y8T细胞通过其受体ySTCR识别结核菌蛋白而介导抗结核菌感染的机制，我们对结核菌H37Rv株重组蛋白Rvll94c进行了原核表达和鉴定。在设计引物和得到模板后，我们通过聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)获得了目的基因扩增产物。检测基因序列正确后，我们将目的基因连接表达载体并转化表达菌株，

8、最后使用异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(Isopropylp-D-1