不同淋巴道转移潜能的小鼠肝癌克隆细胞株的分离和建立

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1、不同淋巴道转移潜能的小鼠肝癌克隆细胞株的分离和建立陈万远计：学位论文：39页表格：3个插图：12幅指导教师：张宏颖副教授申请学位级别：硕士学位专业名称：病理学与病理生理学论文提交曰期：2012年4月论文答辩日期：2012年6月学位授予单位：大连医科大学学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明I煳燃本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究

2、所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：2尘∑年』月竺日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OODOQOQ00⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(一)月lJ吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯一。7(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯15(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39不同淋巴道转移潜能的小鼠肝癌克隆细胞株的分离和建立硕士生姓名：陈万远指导教师：张宏颖副教授专业名称：病理学与病理生理学摘要目的：肿瘤的侵袭与移转是恶

4、性肿瘤最基本的生物学特性之一，也是肿瘤患者死亡的重要原因。然而，有关转移的确切机制目前尚不十分清楚。因此，肿瘤转移一直是肿瘤学研究的一个热点。建立理想的肿瘤转移动物模型对深入研究肿瘤转移机制具有重要的意义。小鼠腹水型肝癌H(22)细胞瘤株属于小鼠的肝细胞癌，接种于小鼠皮下呈结节状增长，移植于小鼠腹腔呈腹水型增长。建立H(22)实验性转移模型对研究H(22)肿瘤本身及筛选控制癌转移的药物等方面的基础研究具有非常重要的意义。HCa．F和HCa．P是从H(22)腹水癌克隆出的具有高低不同淋巴道转移潜能的细胞株，高转移株HCa．F淋巴道转移率可达到70—80％，而低转移株HCa．P

5、淋巴道转移率仅为0．20％。这种小鼠腹水癌(H22)实验性淋巴道转移模型是一个较适用的并符合自然转移规律的动物模型，此模型已广泛地应用于肿瘤基础研究及药物筛选，成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型。研究肿瘤的淋巴道转移机制，不论是在组织病理学水平、细胞生物学水平、还是在分子生物学水平，有一个良好的参比对照系统是非常重要的。但该模型的缺点是缺乏无转移株对照，因此分离与建立包括无转移株在内的具有不同淋巴道转移力的单克隆株模型对可为推动深入研究肿瘤淋巴道转移机制、寻找预测转移的新指标、筛选防治新策略奠定工作基础。本文以小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株HCa．P为瘤

6、源，采取有限稀释法克隆出细胞株，经过小鼠足垫接种实验检测其淋巴道转移潜能，从细胞形态、细胞生长曲线、群体倍增时间、基质金属蛋白酶2和9(MMP．2，MMP．9)的分泌、细胞迁移与侵袭等方面检测克隆细胞株的生物学特性，目的是筛选出具有不同淋巴道转移潜能的小鼠腹水型肝癌细胞株，为建立转移力逐级增高的阶梯转移小鼠肝癌细胞模型系统奠定基础，为肿瘤淋巴道转移机制的研究提供一个更为理想的实验模型。方法：细胞单克隆：利用小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株HCa—P为瘤源克隆细胞，采用有限稀释法从中分离出单个细胞，在96孔板中进行克隆细胞培养，按细胞株在96孔板中的位置分别命名。在体外进行克

7、隆细胞培养。待96孔板内细胞长满板底，转移到24孔板继续培养，再转移至培养瓶加液扩大培养，每个细胞独立生长成细胞株。将各细胞株接种于小鼠脚垫，检测成瘤率和淋巴结的转移率。筛选出转移潜能不同的细胞株。生物学特性检测：检测各克隆细胞株和HCa．P生物学特性，通过同步化培养在倒置显微镜下观察细胞形态，通过绘制生长曲线的方法检测和对比各细胞株生长速度，并且以生长曲线计算各细胞株的群体倍增时间。采用WesternBlot测定各细胞株中基质金属蛋白酶2(MMP．2)的表达水平；利用明胶酶谱实验检测各细胞株分泌基质金属蛋白酶2和