人脐静脉内皮细胞分离鉴定及其膜分子表达水平在肿瘤微环境中的变化

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterT●J●■●●J●●’·●●’■o⋯o●lS0latlonannlnentltlCation0tnumanumDilicalC0rdendothelialcellandtheeffectoftumormicroenvironmentontheexpressionofmembranemoleculesonvascularendothelialcellsByJingYangSupervisor：Prof．YingDuImmunologyCollegeofBasi

2、cMedicalScienceMay2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：者为晶日期：五纠2年f月谚日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大

3、学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：才刍晶日期：如／≯年歹月z万日]r——摘要人脐静脉内皮细胞分离鉴定及其膜分子表达水平在肿瘤微环境中的变化摘要背景及目的：肿瘤微环境(tumormicroenvironmentTME)影响着肿瘤细胞的增殖，分化，组织特异性转移，免疫逃逸及抗药性的形成。在肿瘤微环境中，血管内皮细胞(vascularendothelialc

4、ell，VEC)发挥着关键性的作用，不仅为肿瘤的生长提供营养，也是免疫反应的调节者和效应者。在肿瘤的血行转移过程中，肿瘤细胞和微血管的相互作用是肿瘤转移的限速步骤。肿瘤微环境包括多个生理区域，具有多层次的作用帮助肿瘤的扩散和转移，但迄今为止相关机制尚不完全清楚。为了研究不同类型肿瘤微环境，以及随着肿瘤微环境作用时间的增长和作用的增强而对血管内皮细胞的膜表面分子表达量的影响。本实验采用脐静脉内皮细胞体外培养和实时荧光定量PCR的方法，研究肿瘤微环境对血管内皮细胞的粘附能力相关分子(VCAM．1、ICAM．1、CD29、CD3l、CD62E)，抗原提呈能力相关分子(MHC．

5、II、CD80、CD86、CD40)表达的影响。rrr——摘要方法：1、人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，H小厂EC)的分离培养和鉴定：0．25％胰蛋白酶在37"C-F消化15．20min获得HUVEC，常规培养，利用免疫组织化学测定HUVECVIII因子相关抗原的表达；2、不同类型肿瘤细胞培养上清对HUVEC膜标志的影响：将HUVEC传代培养至第3代时，分别加入50％SGC7901细胞培养上清和50％SMMC7721培养上清，诱导48h，并与之与对照组相比较。利用荧光定量PCR法测定其VCAM-1、ICAM．1、CD

6、29、CD31、CD62E、MHC．II、CDS0、CD86、CD40的CT值。采用2。△△Q法计算得到相对基因表达量；3、肿瘤上清不同作用时间对HUVEC膜标志的影响：50％SMMC7721细胞培养上清分别诱导HUVECOh，24h，48h，72h，荧光定量PCR法检测膜标志的CT值；4、不同浓度肿瘤上清对HUVEC膜标志的影响：0％，50％，70％，lOO％SMMC772l细胞培养上清诱导48h。荧光定量PCR法检测膜标志的CT值。结果：l、HUVEC的分离培养和鉴定：培养第2d即可观察到HUVEC贴壁，呈铺路石样排列。组化结果显示：胞浆内可见棕色颗粒，VIII因子

7、染色阳性。2、不同类型肿瘤微环境对HUVEC膜标志的影响：50％SMMC7721培养上清，诱导48h后VCAM．1，CD31，CD29，CD86表达低于正常值，而CD62E，CD80表达高于正常；50％SGC7901细胞培养上清，诱导48h后，ICAM·l，CD31表达低于正常值，CD62E，CD80表达高于正常值。3、肿瘤上清不同作用时间对HUVEC膜标志的影响：50％7721培养上清，诱导24h后，CD86，CD40表达低于正常值，ICAM．1表达高于正常值；50％SMMC7721培养上清，诱导48h后，VCAM．1，CD31，CD2